层析柱： Source 30Q XK16/20 CV=24ml
缓冲液： 平衡及上样缓冲液0.4 M Nacl; 10 mMEDTA;
100 mMTriscl pH 7.0
洗脱缓冲液： 1.0 M Nacl; 10 mMEDTA;100 mMTriscl pH 7.0
上样： PlasimdSelect纯化的质粒，加入4倍体积的水稀释

上样后，以平衡缓冲液洗脱未结合DNA，以B液梯度洗脱，见图3。

以上试验为10升发酵液 —— 菌体300克—最终纯化10毫克的超螺旋质粒DNA (6.1kb) (此试验在非GMP条件下进行)。

纯化的结果如下，见表2。

1. 问： 第一步Sepharose 6FF纯化过程中硫酸铵的浓度与不同来源的质粒有关吗？
答： 硫酸铵的浓度与质粒的来源及质粒的大小无关，试
验已经证明只有在1.5 M的浓度以上质粒DNA才能与RNA完全分离。如浓度低于1.5 M，质粒RNA会有残留。如浓度很低，质粒DNA根本不能与RNA分离。

2. 问： PlasmidSelect纯化超螺旋质粒DNA的原理？
答： PlasmidSelect是以琼脂糖Sepharose 6FF为基架与2硫吡啶共价结合，PlasmidSelect特异与超螺旋DNA，而不与开环DNA和RNA结合。其原理还在研究。超螺旋DNA与PlasmidSelect的特异结合是在2 M硫酸铵pH 7.0的条件下。如果硫酸铵的浓度较低，开环的DNA就会与PlasmidSelect结合，从而降低超螺旋DNA的纯度。

3. 问： 第一步离子交换层析的目的？
答： 离子交换的目的是浓缩、去除内毒素及精细纯化，如果要求质粒的纯度不是很高，此步骤可以省略。离子交换时可以选择线性洗脱，也可以选择阶段洗脱。

4. 问： PlasmidSelect凝胶可以使用多少次？
答： PlasmidSelect是一种琼脂糖凝胶，他与其它新一代Bioprocess凝胶一样，只要做好样品前处理，层析后
及时在位清洗，凝胶的寿命可以是很长的。一般使用几十次甚至几百次都是没有问题的。