转录组深度测序
 


一、454深度测序 ---适合Denovo测序

454机型

测序原理
测序流程

 

技术特点:
  •  速度快:一个测序反应耗时10个小时,获得4-6亿个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍;
  •  读长长:单个序列的读长更长,平均可达到300~400个碱基;
  •  通量高:每个反应可以得到80万以上个序列读长;
  •  准确度高:单一读长的准确性可以超过99%;
  •  一致性好:测序结果一致性超过99.99%;
  •  简便高效:不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等烦琐的工作。

          欧易生物利用自己在建库方面的技术特长以及生物信息方面的分析力量,多年来持续跟踪并发展围绕深度测序的配套技术,同时联合美国具有丰富454测序经验的资深深度测序CRO公司,双方优势互补,共同为国内客户提供454转录组测序技术服务。与传统测序相比,显示出极高的性价比,时间方面更是具有绝对优势,454深度测序在大幅度节省经费的同时,大大提速了研究进程。

    二、solexa测序
    1、转录组测序
    hiseq 2000
    技术参数
    极大的数据产出量
    Initially capable of up to 500-600 Gb per run
    2 x 100bp read length
    Fastest data rate
    ~70 Gb/day
    7-8 days for 2 x 100 bp
    Highest number of reads
    > 3 B single-end reads*
    > 6 B paired-end reads

    测序原理
    C:\Documents and Settings\shi\桌面\seq by synth.jpg
    测序流程
    C:\Documents and Settings\shi\桌面\20110420025025_23_11.jpg

    454和solexa的比较

    Solexa

    454

    剪切变异、染色体重排

    可行

    可行

    基因表达丰度分析

    Reference

    De novo

    差异基因表达

    Reference

    可行

    新基因/转录本的发现

    不可行

    可行

    新基因组中基因区间的识别

    可行

    推荐(读长长)

    拼接全长基因

    可行

    推荐(读长长)

    SNP/SSR位点发现

    可行

    推荐(读长长)

    分析等位基因特异性
    表达

    可行

    推荐(读长长)


    生物学分析

    2、数字表达谱(第二代)

    数字基因表达谱升级版RNA-Seq(Quantification)
          数字基因表达谱升级版是用来研究某一生物对象在特定生物过程中基因表达差异的技术,具有定量准、可重复性高、检测阈值宽、成本低等特点,已广泛用于农业上的分子育种、药物基因组学和疾病分型等

    技术路线

    http://www.genomics.cn/data/attachment/image/4(5).jpg

    生物信息分析内容
    • 测序评估
    • 差异表达基因筛选
    • 表达模式聚类分析
    • GO功能显著性富集分析
    • Pathway显著性富集分析
    • 蛋白互作网络分析

    1.实验流程

    http://img1.jiansuo.net/cms/upload/asset/2010/12/10/1291964935.jpg


    2. 标准信息分析流程

    http://img1.jiansuo.net/cms/upload/asset/2010/12/10/1291964936.jpg


    3.技术优势
    ◆ 高重复性

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          通过对UHRR和HBRR标准品进行重复性研究(如图3)证明,两个样本的技术重复相关系数均可达0.99以上,可见,RNA-Seq(Quantification)具有极好的技术重复性。
    ◆ 检测阈值宽

    http://img1.jiansuo.net/cms/upload/asset/2010/12/10/1291964938.jpg


          从图4中基因表达量检测范围看,RNA-Seq(Quantification)不仅检测范围比Affymetrix芯片宽,而且比Affymetrix更易检测到低丰度的基因。

    定量准确

    http://img1.jiansuo.net/cms/upload/asset/2010/12/10/1291964939.jpg

          用qRT-PCR和RNA-Seq(Quantification)两种方法进行UHRR和HBRR基因表达差异研究,结果相关性如图5所示: RNA-Seq (Quantification)与qPCR研究结果相关系数为0.915,表明RNA-Seq (Quantification)技术定量准确性高。



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