应用广场——中草药黄酮类有效成分纯化方法  
 

具有广泛实际应用价值的中草药黄酮类有效成分纯化方法

安玛西亚公司 解红艳 陈昕

 

素有“活化石“之称的银杏是冰川时期的存活在地球上孑遗植物,而中国的银杏占世界资源的70%左右1。银杏中的有效成分包括银杏黄酮、黄酮甙2-3、内酯4、银杏酸4、多糖等5。有报导银杏可抗过敏、预防老年痴呆症、作为减轻焦虑和压力的情绪提升剂、改善失聪以及对心脏病、阳痿、中风、静脉曲张、眩晕、黄斑退化和经前症,均有一定的疗效2,3。

葛根中含有黄豆苷元、黄豆苷、葛根素、7-木糖葛根素,金雀异黄酮,葛雌素及黄豆苷元4,7-二葡萄糖苷等。其中葛根素具有改善心血管循环、降低心肌耗氧量功能,对缺血性心脏血管疾病有治疗效果6,7。最近的研究表明葛根素对视网膜充血、结膜炎也有一定的疗效8。

虽然银杏黄酮、葛根素的纯化方法已有很多报导,但步骤繁多9,10、最终回收率很低。由于这类中草药粗提物中带色素的成份极多,无论使用硅胶、氧化铝或Sephadex LH-20凝胶精纯,目标产品往往被其它色素成份掩盖,检测追踪极为困难。或经过反复多次层析,目标产品损失极大。针对这一普遍存在的问题,我们采用阴离子交换介质Q Sepharose FF先吸附大部分色素杂质,再用Pharmadex LH-20 (Sephadex LH-20) 凝胶精纯了银杏黄酮和葛根素,效果事半功倍。我们发现此方法适合不少其它中草药中黄酮类物质的精纯,具有广泛的实际应用意义。

● 原材料
由甘肃药材公司提供,银杏提取物含银杏黄酮纯度40%,葛根提取物含葛根素70%。

● 仪器及试剂
层析设备: ÄKTA explorer 100
层析介质: Q Sepharose FF和Pharmadex LH-20(Sephadex LH-20)
层析柱: HiTrap Q Sepharose FF、XK 26/40和XK26/100
试剂: 乙醇 (分析纯) 氯化钠 (分析纯) Tris (分析纯)

● 实验方法
1. 样品制备:
将含银杏黄酮40%纯度的银杏提取物和含葛根素70%的葛根提取物分别用70%乙醇和无水乙醇各提取一次,

 

提取时搅拌并在55℃的恒温下保持2 h,混合两次提取液。然后,加入7倍pH 8.0的0.1 M Tris-HCl,使样品含70%的0.1 M Tris-HC和30%的乙醇。

2. 第一步使用Q Sepharose FF进行纯化
纯化条件:
Buffer1: 0.1M Tris-HCl +30%Ethanol (pH8.0)
Buffer2: Buffer1+1M NaCl (pH8.0)
Column: HiTrap Q Sepharose FF

纯化方法:
1. Buffer1平衡HiTrap Q Sepharose FF柱。
2. 将上述已处理好的30 ml样品上平衡好的Q柱。
3. 清洗没有结合的样品10 ml。
4. 进行线性洗脱15 ml,并进行自动峰收集。
5. 确认收集到目标产品后,用1 M NaOH/1 M NaCl对层
析柱进行清洗和再生。介质反复使用数十次后,效果不变。

 
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