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| 图2. 细胞数目和发光量的相关关系。CellTiter-GloTM
测试系统测定的细胞数目与发光信号之间存在直线关系。在384孔不透明白色板 上用培养基RPMI+10%FBS倍比稀释Jukat细胞，样品体积为每孔2
5μl。加入等体积的CellTiter-GloTM试剂并混匀，10分钟后采用Wallac
VictorTM 1420仪记录发光量。图中显示的数据为8个孔细胞测量值的 平均值及标准差(0-4,000个细胞/孔，线性回归系数r
2=0.99)。学生T检验表明4个细胞的发光量与背景存在显著性差异(p≤0.001)。RLU 为相对光单位。
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异。
用测量ATP作为有活力细胞数的指示剂，这种方 法已越来越多地得到认可。最近来自体外细胞毒性评估中心的报告显示ATP浓度分析是最有预示性的毒性
测试方法(2)。当细胞活力丧失时，膜完整性破坏，ATP 水平快速下降，其原因为破损细胞不能合成更多ATP，且ATP酶可降解存在的ATP。如图3所示，当细胞膜
裂解时，ATP浓度快速降低。这些数据进一步证实了用ATP作为一个有活力细胞标记的有效性。
CellTiter-GloTM测试采用Promega公司特有的、热稳定性荧光素酶。这种独特的荧光素酶测试条件可抑制内源性ATP酶活性，因而进行荧光素酶反应可延
续几个小时。荧光素酶的稳定性允许研究者测试时均质地加入一种试剂。CellTiter-Glo TM试剂可抑制内源性ATP酶活性，在这种反应条件下，发光信号可维持几个小时。图4显示了CellTiter-GloTM缓冲液中含有对 ATP酶起抑制作用的抑制剂。CellTiter-GloTM
测试产生的发光信号半衰期一般大于5小时，因不同的细胞 种类、使用的培养基和血清而异(图5)。发光信号半衰
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图3.
在普通培养条件下细胞裂解时ATP水平快速下降。CHO细胞接种到96孔板(15,000/孔)，培养基为DME/F-12+10%FBS，
37℃，5％CO2过夜培养贴壁。滴加0.2％皂角苷裂解细胞(4个孔)，37℃培养指定的时间，使ATP酶发生作用。然后加入CellTiter-Glo
TM试剂测定样品中ATP量。RLU为相对光单位。 |
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| 图4. CellTiter-GloTM试剂对ATP酶的抑制作用。将培养在10％
马血清的DME/F-12 (1:1)的L929细胞(1.5×105/ml)冻融3次使细胞
裂解。细胞裂解液放置在22℃，其中一瓶细胞裂解液加入等体积的 50mM HEPES(pH7.5,无抑制剂)，另一瓶加入等体积的CellTiter-GloTM缓冲液(抑制剂)。而后每隔60分钟取出10 0μl液体，加入20μl 5×CellTiter-GloTM试剂溶液并混匀，测定发光信号产量，共测量5次，每个时间点取4份样品。 |
| 期长，因而在用多孔板测试时不必使用配备注射器的 荧光发光仪，操作简便灵活。
和其它常用的细胞毒性测试方法的比较
测定ATP法和其它常用的细胞活力测试方法是密切相关的，图6显示了TNF α细胞毒性的测定，比较了CellTiter-GloTM测试方法和CellTiter
96® AQueous 法，一种通过测定MTS四唑还原产物进行分析的溶液细胞增殖检测技术。尽管采用不同的细胞代谢物作为指示
剂，但两种方法得到的ED50值相似(~8pg/ml)。另外我们用CellTiter-Glo TM测试系统检测了Jurkat、
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