普洛麦格中文通讯 2002年第五期
 
 

图2:采用Wizard® SV凝胶及PCR纯化系统凝胶纯化前后PCR 产物凝胶电泳分析。图中所示DNA片段纯化前为U及纯化后为P。上 样孔1为1kb DNA Ladder分子量标准(产品目录号:G5711)。

化重为350mg 1%琼脂糖/TAE凝胶条,电泳检测纯化产物来计算的。每一凝胶条用一个柱。用较热的水 (65-80℃)洗脱DNA可提高大片段DNA的回收率。每个柱子可容纳高达40μg DNA,而凝胶条中少至10ng的DNA,用该系统也可成功纯化。

  图3和表2显示了用直接纯化方法提纯的不同大小片段PCR产物的平均回收率。其中,100bp, 200bp, 500bp, 1,000bp, 和1,500bp PCR产物是用PCR Master Mix (产品目录号:M7501,M7502,M7505)制备,而3,199bp DNA产物是将pGEM®-3Zf(+)载体线性化提纯的,回收率由凝胶电泳分析。该系统能从扩增反 应产物中除去非结合的引物,石蜡油不会影响纯化。 

  Wizard® SV凝胶及PCR纯化系统对很多扩增酶、缓冲液及加强PCR添加剂均适用。我们检测了13种不同PCR添加剂对1000bp PCR产物纯化效率的影响(见表3),结果表明所有检测的添加剂均适用Wizard® SV凝胶及PCR纯化系统直接纯化。

图3. 采用Wizard® SV凝胶及PCR纯化系统直接纯化PCR产物前后的凝胶电泳分析。 图中所示DNA片段纯化前为U及纯化后为P

    标准操作步骤洗脱DNA采用50μl无核酸酶水。操作中也可使用少至15μl的洗脱体积以便得到高浓度的纯化产物。表4显示了直接纯化700bp PCR产物时采用不同洗脱体积的回收率,纯化的DNA产物定量采用3次凝胶电泳平均结果。建议不使用10μl和更少的洗脱体积,因为10μl水不能完全浸湿套管的硅膜,DNA回收率显著降低。

功能性
用本系统凝胶纯化1000bp PCR产物,检测纯化产物用于T载体克隆、限制性酶切及自动荧光测序的效果。结果是纯化的DNA可成功克隆到pGEM®-T Easy载体中,所有检测的限制性内切酶(BamHI,EcoRI,HindIII)酶切完全,用ABI BigDye®荧光测序试剂测序可读取大于700bp长度,准确度大于98%(图 4)。另外采用TAE或TBE凝胶块纯化,在回收率、克

隆、酶切及测序上表现没有差异(数据没有显示)。将相 同1000bp PCR产物直接用本系统纯化后可观察到相似结果(数据没有显示)。
凝胶纯化的DNA片段不需进一步处理可直接用作

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