采用T-载体系统克隆PCR产物时，为什么 筛选时只得到蓝斑？
对于T-载体克隆出现的问题，故障排除的第一步 是采用阳性对照检验。所有Promega公司T载体系统都提供一个插入DNA阳性对照，用来检测连接效率。当使用转化效率1×108cfu/μg
DNA的感受态细胞时,大概产生100个克隆，其中10-30%为蓝斑，至少60%为白斑(重组子)。如果阳性对照不能产生预期结果，应检查以下几个项目。
●感受态细胞效率？确保你的感受态细胞效率至少为 1×10 8cfu/μg DNA。将感受态细胞转化0.1-1.0ng环状质粒DNA，在适当抗生素培养基上过夜培养，
计算克隆菌数目，以此测定感受态细胞效率。注意要用几个稀释度的转化细胞涂板(1:10,1:100)，以确保克隆菌数目易于计算。Promega公司高转化效率JM109感受态细胞(产品目录号：L2001)是很多T-载
体克隆的理想选择。
●2×快速连接缓冲液或T4连接酶10×缓冲液是否可 以冻融多次？因为这些连接缓冲液含ATP，冻融多 次易引起降解，所以一般将连接缓冲液按一次用量
分装后保存，以避免反复冻融引起ATP失活。也可在连接缓冲液中补加ATP到终浓度1mM以补偿失 活ATP。
●T4DNA连接酶是否具有活性？将一个载体质粒单 酶切产生粘性末端，用此酶切产物进行连接反应，可 检测连接酶活性。注意连接反应一定要使用系统自己提供T4DNA连接酶，因为这种连接酶核酸外切酶活性最低。而T4
DNA连接酶的核酸外切酶活性可降解T-突出端和A-突出端，连接时引起载体自连，编码完整的有功能的β半乳糖苷酶，造成克隆
菌蓝斑数多于白斑。
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