普洛麦格中文通讯 2002年第五期

GFP+ 细胞的百分比, 以便计算转染效率。剩下的细胞生长72小时后将其裂解，并定量蛋白质。从每一个样品中取等量的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 然后转移到硝酸纤维素膜上。用P53单克隆抗体进行检测。用肌动蛋白的抗体来确定每一泳道的加样量是否相等(图5)。然后通过光密度计来定量蛋白条带，用肌动蛋白的加样对照来确定和较正P53量的减少。

图5. 内源P53蛋白的抑制。在12孔板上,用1mg/孔的U6盒（每种PCR产物0.5 mg）和6ml/孔的siLentGene^TM转染试剂转染293T细胞。然后将细胞培养72小时，裂解，蛋白定量。在10% tris-甘氨酸凝胶以5mg蛋白/泳道进行电泳，再转移到硝酸纤维素膜上。两种探针，即P53(1∶1,000 Calbiochem Ab-2)抗体和作上样量对照的β-肌动蛋白(1∶5,000 Abcam， Ab6276)与膜杂交。用羊抗鼠辣根过氧化物酶偶联抗体作二抗，然后进行化学荧光检测。第一泳道是非特异性U6盒负对照。第二泳道转染的是P53 U6盒。实验进行了一次重复。

　　P53实验显示平均抑制量是53%。在同一时间点 GFP转染效率是40%。U6盒抑制水平比质粒标志物的转染效率略高。

核纤层蛋白A/C表达的抑制

　　目标基因表达的降低一般通过Western杂交研究细胞群体，或免疫细胞化学对单个细胞来进行分析。人类核蛋白----核纤层蛋白 A/C，因其曾被合成的siRNA在细胞培养物中有效地抑制(12，13)，故在这里被选作目标基因。HeLa细胞被含有正义和反义目标序列的siLentGene ^TM U6 盒转染(图6，B和D)或被含有非特异序列的U6盒转染(图6，A和C)。转染72 小时后，细胞用抗核纤层蛋白A/C(红)或抗核纤层蛋白B1(绿)的抗体固定和染色。图6，B表示当HeLa细胞被能产生针对核纤层蛋白A/C目标序列的siRNA的U6盒瞬时转染后，核纤层蛋白A/C降低。而转染非特异序列的U6盒(图6，A)时没有降低。另外，核纤层蛋白A/C PCR盒不影响核纤层蛋白B1的表达，暗示观察到的效果是特异的(图6，C和D)。

结论

　　siLentGene^TM U6 盒 RNA 干扰系统快速、便宜，以PCR为基础在细胞内表达siRNA。它为鉴别最佳 siRNA目标序列和接下来进行的范围广泛的基因抑制测试提供了一个有用的实验工具。

图6. 用含有siRNA的PCR盒转染HeLa细胞抑制核纤层蛋白A/C的表达。用核纤层蛋白A/C U6表达盒(图B、D)或非特异性U6表达盒(图A、C)转染HeLa细胞。细胞被核纤层蛋白A/C抗体(图A、B)或核纤层蛋白B1抗体染色，聚焦显微镜分析。

参考文献：

1. Fire, A. et al. (1998) Nature 391, 806-811.
2. Hannon, G.J. (2002) Nature 418, 244-251.
3. McManus, M.T. and Sharp, P.A. (2002) Nat. Rev. Genet. 3, 737-747.
4. Hammond, S.M., Caudy, A.A. and Hanon, G.J. (2001) Nat. Rev. Genet. 2, 11-19.
5. Grishok, A. and Mello, C.C. (2002) Adv. Genet. 46, 339-336.
6. Billy, E. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 14428-14433.
7. Paddisn, P.J., Caudy, A.A. and Hanon, G.J. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1443-1448.
8. Martinand, C. et al. (1998) J. Cytokine Res. 18, 1031-1038.
9. Farrell, P.J. et al. (1977) Cell 11,187-200.
10. Groskreutz, D. and Schenborn, E. (1994) Promega Notes 48, 8-12.
11. Reznikoff, C.A. (1996) Sem. In Oncology 23, 511-584.
12. Elbasher, S.M. et al. (2001) Nature 411, 494-498.
13. Harborth, S. et al. (2001) J.Cell Sci. 114, 4557-4565.

操作手册：

siLentGene^TM U6 Cassette RNA Interference Syetem Technical Manual, ^TM061, Promega Corporation.
　 (http://www.promega.com/tbs/^TM061/^TM061.html)