普洛麦格中文通讯 2002年第五期

了解RNA的抑制效果。与非特异性序列相比，所有5 个被选择的目标序列都降低了hRluc的活性(图3)。然而，抑制水平从20-70%不同，暗示不同区域导致的敲掉效果能力不同。位点3很可能为今后的实验提供最强的RNAi效果。相反，位点4的抑制效果最差，因此做功能研究时不会将它作为选择位点。为RNAi实验选择最有效的序列是了解基因功能丧失效果研究的关键，siLentGene^TM系统为快速评估多个目标位点提供了有用的工具。

图3. 在稳定CHO细胞系中人性化海肾荧光素酶表达的抑制。在转染前一天，将稳定表达hR luc的CHO细胞铺入96-孔板，密度是3x103 细胞/孔(50%铺满)。第二天，用0.05mg的一个DNA盒转染细胞， DNA盒来自5个hRluc位点[位点1(从ATG数75-93) ；位点2(从ATG数297-315) : 位点3，(从ATG数375-393)；位点4(从ATG数508-526) ；位点5(从ATG数756-776)]，或用非特异对照序列转染。另一些孔的细胞用0.1mg能表达GFP的载体(目录号E6421)转染以确定转化效率。每一个样品加入到10个孔中，用5孔确定海肾荧光素酶活性，用另5孔确定细胞数目/活性。海肾荧光素酶活性由海肾荧光素酶检测系统(目录号E2810)测量。细胞数目/活性用CellTiter-Glo^® 荧光细胞活性检测(目录号G7570)确定。数据表示的是与非特异对照相比，转染了特异目标序列的每一数目细胞海肾荧光素酶活性降低的百分比。结果显示四次实验的平均值。

确定最佳抑制条件

　　能稳定表达报告基因(如人性化海肾荧光酶基因) 的细胞系是便于优化检测的系统。我们生产了几个能稳定表达海肾荧光酶的细胞系。这些细胞系被用来优化关键抑制参数。以不同密度将细胞铺在平板上，然后用针对位点3目标序列的正义和反义的U6盒转染细胞(如图3所述)。经过96小时后，通过监控hRluc的活性来确定抑制水平。

在平行实验中，细胞数的变化也进行了48-96小时的监控。转染高密度细胞显示较小或没有hRluc活性的抑制，但是较低的细胞密度转染显示hR luc基本上被抑制(最多至

图4. 细胞生长与hRluc活性抑制的关系。实验在96孔板中进行。每一样品转染10孔，其中5孔用来确定海肾荧光酶活性(图A) ，5孔用来确定细胞数目/活性(图B)。转染后96小时确定海肾荧光酶表达的抑制。根据转染后48-96小时增长的细胞数计算生长百分比。图3描述的用位点3盒转染的细胞的荧光素酶活性被用来与非特异序列盒转染的细胞进行比较。

60%，图4)。

　　这些结果可能是由于平铺生长的细胞合成的蛋白质量非常少，使得RNAi的效果降低。细胞增殖数据显示，以高密度接种的细胞比低密度接种的细胞生长慢得多。这暗示维持健康的细胞培养物是保证siLent GeneTM U6盒RNA 干扰系统成功的基础。

抑制内源基因表达：P53案例分析

　　转录因子P53是人类癌症中最常突变的抑制基因(11)。P53蛋白半衰期较短，但可通过点突变或特定DNA肿瘤病毒，如SV40大T抗原的作用使其稳定。为测试对P53蛋白的抑制，我们使用了293T细胞系，因为它含有SV40大T抗原，可以稳定P53蛋白质，使 P53有高水平积累。铺板24小时之后，用P53的U6盒或非特异性对照转染细胞。同时，也用GFP载体转染细胞。转染之后48小时确定