普洛麦格中文通讯 第七期 2003
 
 

酸突出的dsRNA,却不会诱发这些抗病毒机制,而可以成功介导基因特异性抑制。短dsRNA可在体外合成,再导入哺乳动物细胞。或者,可用DNA载体将 siRNA送进哺乳动物细胞,从而进一步扩展了RNAi在哺乳动物细胞中的用处。 

  不过,这些新方法成功的基础是必须能够在目标mRNA内正确地选择一个最佳表达的特异区域。虽然设计了一些公式来估计一个给定siRNA对它的目标表达的抑制效果,但是,最佳区域的选择仍然基本上是一个试错过程。因此,一般会对每一个目标选择多个区域,再对这些区域进行筛选。筛选可用合成的RNA 进行,但这很昂贵;筛选也可以用克隆的DNA序列,但克隆很花时间。siLentGene TM U6盒RNA 干扰系统避免了昂贵的RNA合成和费时费力的DNA克隆过程,使筛选siRNA序列的过程较为快速和容易。 得到有效的目标序列就能产生有效的siRNA-介导的基因特异性抑制,使RNAi技术在哺乳动物细胞基因功能分析中成为强有力的工具。

siLentGeneTM U6盒 RNA 干扰系统

  该系统将DNA盒方法所产生的siRNA产物,直接快速而经济地送入细胞。siRNA序列是由设计的引物经PCR方式产生的, 且被置于U6启动子和终止子的控制之下, 而U6启动子和终止子是基因工程的产物。PCR产物直接转染细胞,避免花费大量的劳动克隆每一段序列(图2)。 

  在被转染的细胞内, 序列相对简单的启动子和终止子指导内源的RNA聚合酶III大量制造siRNA。终止子包括一小段尿嘧啶,这符合原始的siRNA终止序列,即3’突出的两个尿嘧啶(9)。siLentGene TM系统快速、便宜,提供了一个快速筛选和确定不同的siRNA效果的手段。 

  该系统提供上游引物和一个作为PCR模板的U6盒DNA。下游引物由使用者自行设计。下游引物应包括3个部分:与U6盒退火的区域,含有未来将转录成siRNA序列的区域, 和一个U6终止序列。产生的PCR产物,即U6表达盒,包括U6启动子,正义或反义 mRNA目标序列,和一个终止子序列。

  在实验中将产生两个表达盒,一个表达反义 RNA,一个表达正义RNA。经过柱纯化后,这两个盒被合并在一起,使用siLentGene TM转染试剂转染合适的细胞系(图2)。

  转染之后,转染细胞中的内源RNA聚合酶III从每一个表

 

 

达盒中转录一小段RNA。产生的互补RNA退火形成siRNA二聚体。这些二聚体在转染细胞内部诱发目标mRNA的特异降解。

筛选最佳目标序列

  RNA干扰实验的关键是确定最佳的目标序列。因为预估一个给定目标的最佳RNA序列是不可能的,因此, siLentGeneTM技术提供了一个快速便宜地评估多个目标的理想方案。下列实验描述了这种方法。按照siLentGene TM U6 盒 RNA 干扰系统技术手册,TM061的一般指导, 在人性化海肾荧光素酶 hRluc (注: 人性化海肾荧光素酶hRluc是Promega 根据天然海肾荧光素酶的基因序列而人工合成的一个酶基因, 用做报告基因, 详见《Promega公司荧光素酶技术系列产品指南》,见www.promega.com.cn) 的编码区选择了5个不同的目标序列。对每一个目标序列制造两个DNA 盒,一个含有正义序列,另一个含有反义序列。用小柱纯化PCR产物然后转染CHO细胞系, 稳定表达hRluc。通过监控海肾荧光素酶活性的降低可以方便地

 


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