普洛麦格中文通讯 第七期 2003
siLentGeneTM U6 盒 RNA 干扰系统
快速筛选目标siRNA
Promega公司：Jolanta Vidugiriene, Ph.D., Thomas Yeager, Ph.D., Cynthia Sprecher, B.S., and Doug Storts, Ph.D. Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司：Lin Wang, Ph.D., Jiwu Wang, Ph.D. and Zhaohui Dong, Ph. D.
 

摘要

　　我们开发、优化了一套在哺乳动物细胞中诱导 RNA干扰(RNAi)效果的试剂盒，该试剂盒用DNA盒表达siRNA。这些DNA盒的特点是具有一个精确而高效的真核RNA聚合酶III U6启动子。表达盒由PCR合成，然后转染所用细胞系，适合于多目标位点的快速筛选。

siLentGeneTM系统快速、廉价，提供快速筛选和确定不同siRNA效果的方便手段。


简介

　　使用双链RNA(dsRNA)沉默基因表达，也就是 RNA干扰或称RNAi，为分析基因功能提供了有力工具。研究人员通过选择性向下调节(或“敲掉”)某一特定基因的表达这种方法，可以确定这个基因在许多细胞学过程中的功能。要了解某一个基因的功能，基因敲掉技术是很有用的工具。另外，简单及预测性强的敲掉技术使新药开发过程获益非浅。

 　　基因敲掉实验对许多生物学研究都有用，例如：绘制细胞学途径，选择适合的药物干预的靶标，开发基因治疗方案。SiLentGeneTM U6 盒RNA 干扰系统为研究者使用RNAi分析基因功能提供了一个方便的工具。

RNAi 现象

　　RNAi指由dsRNA诱导的，能特异地降解与dsDNA同源的mRNA的细胞学过程。在有些系统中，几个拷贝的dsRNA可导致一个细胞中的全部同源转录子降解(1)。现已鉴别出一些在这个过程中发挥作用的基因产物，如果蝇III型RNA酶“Dicer”(2)，“Dicer”将长链dsRNA或发夹状RNA(3)处理成双链小干扰 RNA(siRNA)，这些siRNA一般有21-23个核苷酸(nt)。一旦这些siRNA出现，它们就诱导形成RNA-诱导的沉默复合体(RISC)。复合体中的解旋酶解开dsRNA，

由此产生的单链RNA(ssRNA)就成为选择底物的向导。一旦ssRNA与目标mRNA碱基互配，可能原来就存在于复合体中的核酸酶活性就会使mRNA降解(图1)。

 

图1. RNA干扰机理假说

在哺乳动物细胞中诱导RNAi的方法

　　在Fire et al 1998 (1) 年发现RNAi现象后不久，dsRNA就被成功用于分析线虫，果蝇和植物的基因功能(4，5)。在哺乳动物细胞中，长链dsRNA能在小鼠胚胎肿瘤细胞和胚胎干细胞中诱导特异序列基因的沉默(6，7)。然而，向哺乳动物体细胞导入长dsRNA却可激活抗病毒防御系统，导致RNA转录子的非特异性降解(8)，并使细胞丧失总体的蛋白合成功能(9，10)。这两个机制有效地关闭哺乳动物细胞的正常生理过程，而使dsRNA失去特异的RNAi能力。可是，在哺乳动物细胞中使用短的(21-23 nt)、并在3’端有2个核苷

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