普洛麦格中文通讯 2002年第五期

摘要：

　　为了帮助研究人员进行细胞活性的体外检测， Promega公司开发了CellTiter-Blue^TM细胞活性检测系统。本文涉及了该系统的一般操作方案、测试特点及受试化合物对检测的影响等常见问题。

为了帮助研究人员进行细胞活性的体外检测，Promega公司开发了CellTiter-Blue^TM细胞活性检测系统。

什么是CellTiter-Blue^TM细胞活性检测系统？

　　CellTiter-Blue^TM细胞活性检测用均质、荧光的方法，估计一个细胞群体中活性细胞的数目。这一系统包括CellTiter-Blue TM试剂，即溶解于缓冲溶液中的高纯度的刃天青。刃天青是一种可直接加入细胞培养物中的氧化还原指示剂。细胞可将深蓝色的氧化型染料(刃天青)转化为红色的还原型染料(试卤灵)。因为无活性的细胞很快丧失了代谢能力而不能还原刃天青，也就不能产生荧光信号，所以，该系统特异性检测活性细胞(1)。实验结果可用荧光计或分光光度计记录。

CellTiter-Blue^TM 细胞活性检测系统可以与其它实验方法共用吗？

　　由于CellTiter-Blue^TM 细胞活性检测系统在短时间内对细胞几乎没有破坏作用，因而针对同一细胞群进行一种以上的测试是有可能的。例如，可用CellTiter-Blue^TM试剂测量细胞活性，用Apo-ONE^® 均质Caspase-3/7系统检测其凋亡(2)。我们建议先做预试验来确认欲同时进行的另一实验与CellTiter-Blue TM系统的检测条件是否相容。

CellTiter-Blue TM 细胞活性检测系统的操作过程是什么？

　　将细胞培养于96孔或384孔培养板中。将受试化合物加入细胞培养体系，96孔板内每孔的终体积为100ml，384孔板每孔的终体积为25ml。将培养板置于37℃环境培养一

定时间。当培养板从培养箱中取出后，向每100ml培养基中加入20ml CellTiter-Blue^TM试剂。细胞再培养1-4小时，560 EM/590EX记录荧光。

　　向培养基体积中加入推荐量的CellTiter-Blue^TM试剂可得到较高的荧光信号，较低的背景。不需要细胞洗涤，去掉培养基及多次吸取步骤，这样的均质方法既适合于手工操作，也适合于细胞活性和细胞毒性的高通量自动化筛选检测。

最适的培养时间是多少？

　　不同种类细胞将刃天青还原为试卤灵的能力取决于其代谢能力。对大多数实验而言，1-4小时的培养时间是足够的。对于筛选检测，最佳的每孔细胞数及培养时间应根据经验而定(1,2)。

　　CellTiter-Blue^TM 试剂是一终点检测，而不是一个动态检测细胞增长的方法。试剂应在接近细胞与受试化合物作用结束时加入(3)。延长孵育时间能增加检测的灵敏度(1)。在2小时与刃天青共孵育的时间内，使用低数量的细胞将会产生较少的荧光，然而，将培养时间延长至几个小时则可以提高信号/背景比及降低检测极限。

进行该测试时，需要何种仪器？

　　使用带有560(20) EX/590(10)EM滤光片的荧光计读取荧光。也可选用530-570nm的激发光滤片和580- 620nm的发射光滤片。应注意激发波段与发射波段不能重叠。刃天青的最大吸收波长为605nm，试卤灵的最大吸收波长为573nm。或者，可用分光光度计来记录可见光的吸收。应注意，由于荧光计的敏感性较高，所以宜选择荧光计来收集数据(1)。

我怎样终止反应？

　　向每100 ml培养体积内加入50ml 3%的SDS溶液，可终止CellTiter-Blue^TM 测试反应，并使荧光值稳定。如果保持培养板避光和密封(避免蒸发)，则在读取数据