MagneHisTM
蛋白纯化系统：以多种形式纯化组氨酸标记蛋白
Promega公司：Beckey Godat, M.A., Laurie Orr, B.S., Dan Simpson, Ph.D., Tonny Johnson, Ph.D., Gary Kobs, B.S. |
原文Promega Notes 83第2 - 5页
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摘要
MagneHisTM
蛋白纯化系统提供了一个快速而高效率的纯化组氨酸标记的蛋白的方法。该方法产量高而背景低。灵活可变的实验方案既可用于小规模纯化，又可用于大规模纯化；既适用于手工操作，又适用于自动化工作平台。专利的MagneHisTM 细胞裂解试剂使细胞裂解步骤变得快速而简便。
| MagneHisTM 细胞裂解试剂减少了不必要的处理步骤，缩短了裂解细胞所需要的时间。 |
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前言
应用表达系统产生重组蛋白是一种常规的实验室技术。以此种方式合成的蛋白可被应用于几个不同的方面，包括酶活性检测（1-3），分子间相互作用的研究（如，蛋白-蛋白相互作用，核酸-蛋白相互作用；1，4-6）或结构研究（如X线晶体学、核磁共振（NMR）；7，8）。
融合标记物是加在重组蛋白的N或C端的一小段氨基酸序列。在特定的表达载体中加入融合表达标记物使重组蛋白的纯化和检测变得更为便利。某些标记物被广泛应用是由于它们编码的肽段可被特异性抗体纯化或检测，或者，这些肽段具有独特的、可应用于某种纯化方式的物理性质（如，结合配体）。
组氨酸残基与固化的金属镍之间的亲合性使得含有组氨酸残基的蛋白的选择性纯化成为可能（9，10）。这一现象导致了设计在目的蛋白的C或N端包含5-10个组氨酸残基的特定的克隆载体。与其它标记物相比，组氨酸标记物具有以下几种优势：
6个组氨酸标记物仅增加蛋白分子量0.84kDa，而GST和蛋白A则分别增加26kDa和30kDa。
短小的组氨酸尾巴无免疫原性，因此，当将表达的蛋白给动物注射用以产生抗体时，无需预先去除组氨酸尾巴。
三级结构对于纯化而言并不重要，因而，组氨酸标记的蛋白可在变性条件下进行纯化。
纯化组氨酸标记蛋白的成功方法应满足4个标准：1）细胞裂解要有效。2）非特异性结合要低。3）组氨酸标记的蛋白与镍颗粒的结合要高。4）结合蛋白的洗
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脱要有效。
MagneHisTM 蛋白纯化系统成功地达到了上述标准。
纯化组氨酸标记蛋白的一般过程
典型的纯化组氨酸标记蛋白的过程包括4个基本步骤：
细胞裂解 这一步骤可采用非酶学方法（如，超声或French Press），或使用溶菌酶等水解酶。
结合镍颗粒 细胞裂解后，离心去除细胞碎片。向上清中加入适量镍颗粒，或向镍颗粒分离柱上加入细胞裂解上清。
洗涤 组氨酸标记的蛋白结合到镍颗粒上后，将未结合的蛋白洗涤2-3次。
洗脱 洗脱组氨酸标记的蛋白有2种方法。第1种方法是在恒定的pH下，使用递增浓度的咪唑来取代镍颗粒上的组氨酸。第2种方法采用低pH，在低pH（<4.5），组氨酸被质子化，与镍颗粒不再发生结合反应。
MagneHisTM 蛋白纯化系统对上述这些步骤进行了优化（图1）。
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