普洛麦格中文通讯 2002年第五期

配。荧光素酶特异的氨基酸被替代后，可产生发射绿光和红光的报告基因。另外，我们还对发射红光的荧光素酶进行突变，进一步优化其荧光强度。结果产生的报告基因发射的荧光波峰相距＞75nm，绿色荧光素酶为537nm，而红色荧光素酶为613nm（图2）。

合成基因的效率

为提高荧光素酶基因的表达，采用哺乳动物细胞喜用密码子及起始位点Kozak序列体外合成该基因。序列设计时避免使用哺乳动物转录因子的同源结合位点，这大大降低了由报告基因和宿主细胞内调节蛋白相互作用而造成的异样表达。

图2. Chroma-Luc^TM 酶的发射光谱。将不同的CHO细胞群用pCBR-Control,pCBG-Control或pCBG99-Control进行转染。转染24小时后，加入闪亮裂解液（E2261）裂解细胞，在室温下将相同体积的细胞裂解液和Chroma-Glo试剂混合，并孵育5分钟。采用Spex Fluorolog-2分光萤光计测量发射光谱（将激发光源关掉）。在450-700nm波长范围收集发射数据。

CBG99luc和CBRluc基因有99％的同源性，因此两种报告基因在结构上是相同的，但发射不同颜色的光。在某些应用中，考虑到两个相似基因的基因重叠现象，我们设计了CBG68luc基因，它和CBRluc基因有68.9％的同源性。值得注意的是，尽管CBG68luc和CBRluc基因序列差异显著，但它们编码的荧光素酶氨基酸序列具有98％的同源性。每种报告基因均克隆在以pGL3报告基因载体为基础的目的通用报告基因载体中及含有SV40启动子和SV40增强子的对照载体中。

在哺乳动物细胞中合成的报告基因的表达量远远高于野生型黄绿荧光素酶（图3）。在SV40启动子下，CBG 99luc和CBG68luc基因与野生型的黄绿荧光素酶基因相比，发出的荧光分别高660和550倍。而这个启动子下CBRluc基因的表达比黄绿荧光酶基因高

图3 合成的Chroma-Luc^TM 基因表达提高，三种合成的Chroma-LucTM基因（CBRluc,CBG68luc和CBG99luc）和野生型的黄绿色萤光素酶基因（Ygiuc）分别克隆到pGL3-Control载体中。替代这个载体中的luc 转染24小时后，细胞培养基中加入与培养体系等体积的Chroma-Glo^TM 试剂，用Berthold Centro LB 9600发光仪检测相对光强度。所有数据用转染效率标准化。

28倍。然而，这些数据没有经过光度计的光子检测校正分光效率，因此和发射绿光的报告基因相比，发射红光的报告基因看起来相对较弱。很多荧光光度计使用的光电倍增管在红色区敏感度都比较低。而对于固相光子检测仪，这种偏离则不明显，如CCD为基础的荧光照度仪。

除了较高的表达效率外，合成的报告基因与起源的报告基因相比，具有较高的灵敏度（图4）。可通过检测报告基因载体对一个启动子的反应，即报告基因高于基础表达的量来检测其灵敏度。较低的基础表达可检测较弱的启动子。采用SV40启动子作为参照，合成的报告基因灵敏度提高了10倍。灵敏度的提高可能与移除了野生型基因的异常表达有部分关系。例如，野生型基因的表达在单一增强子下就非常高，甚至高于与SV40启动子结合之后。而比较理想的是，一个增强子不应激活报告基因的表达，除非含有启动子元件。合成的报告基因在只有增强子的条件下表达很低，这较接近预想的理想状况（图4）。

表达的独立性

作为可信赖的共报告基因（co-reporter），绿色和红色荧光素酶基因的表达应该是独立的。这可通过大肠杆菌系统来检测，在大肠杆菌中，通过增强子的调节作用，一种荧光素酶在细胞内的浓度可变化1000倍，而不影响另一种荧光素酶的表达（数据没有显示）。