一种新型生物荧光：不是普通的荧火虫
介绍Chroma-Luc™技术 Promega公司：Brian Almond, Ph.D., Erika Hawkins, M.S., Peter Stecha, B.S., Denise Garvin, M.S., Aileen Paguio, M.S., Braeden Butter, B.S., Michael Beck, M.S., Monika Wood, M.S., Keith Wood, Ph.D.
Chroma-LucTM报告基因载体编码释放绿色和红色荧光的荧光素酶。尽管这两个荧光素酶的氨基酸序列有98％的同源性，但它们产生的荧光波峰相距>75nm。只需加入Chroma-GloTM试剂即可产生两种颜色的荧光，这种试剂可直接加入哺乳动物细胞培养体系中进行均质分析。这种新型载体系统更适用于分析基于两个结构非常相似的报告基因的表达状况，或适用于仅希望加入一种试剂即可进行两个荧光测定的反应。
前言 在细胞生理学分析中，常常将一种特殊的细胞过程和多种参数进行相关分析。这种相关性分析可用于揭示参数之间的关系，或将这些参数与某个内对照做比较。采用报告基因研究转录调控过程时，可通过辅助报告基因等方法检测多种参数。一种常用的方法是使用双荧光素酶报告基因检测系统(产品目录号：E1910)，从一个样品中可检测荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。这两种荧光素酶酶学特性不同，因而产生的荧光也不同。然而，某些应用需要使用结构和化学特性非常相似的报告基因。
为了这个目的，我们开发了Chroma-LucTM报告基因基因载体。这些载体含有Chroma-LucTM基因，其来源于常用的萤火虫荧光酶基因，经过基因工程的方法的改变，其编码的荧光素酶能发射不同颜色的光，其中CBG68luc和CBG99luc基因编码发射绿光的荧光素酶，而CBRluc基因编码发射红光的荧光素酶。这两种颜色的荧光的产生与萤火虫荧光素酶的发光原理一样，因而仅需一种试剂即可检测这些报告基因。这和Dual-Luciferase(r) 报告基因检测系统是完全不同的，在后一种系统中，荧光虫和海肾荧光素酶的反应需加入不同试剂。尽管和荧光虫荧光素酶具有相同的催化机制，但这些荧光酶的反应条件和反应动力学还是存在差异的。为了优化Chroma-LucTM报告载体的操作，我们还研制开发了Chroma-Glo(tm)试剂（产品目录号：E4910，E4920和E4950）。这种试剂可直接加入哺乳动物细胞培养基中进行均质分析。试剂可裂解细胞，激活荧光信号，荧光信号的半衰期大于30分钟。稳定的荧光信号使这种分析方法适用于用无注射器的读板荧光照度仪进行定量分析。由于该系统同时激发绿色和红色发光反应，可使用滤光片将不同荧光素酶的活性区分开。
存在差异的。为了优化Chroma-LucTM报告载体的操作，我们还研制开发了Chroma-GloTM试剂（产品目录号：E4910，E4920和E4950）。这种试剂可直接加入哺乳动物细胞培养基中进行均质分析。试剂可裂解细胞，激活荧光信号，荧光信号的半衰期大于30分钟。稳定的荧光信号使这种分析方法适用于用无注射器的读板荧光照度仪进行定量分析。由于该系统同时激发绿色和红色发光反应，可使用滤光片将不同荧光素酶的活性区分开。
来源于会发光的磕头虫 Chroma-luc(tm)基因来源于自然界存在的发光磕头虫（Pyrophorus Plaglophthalamus）荧光素酶基因（图1，A）。这种较大的甲虫生于加勒比海，具有两套发光器官，可产生不同颜色的荧光；位于头部的一对可发出绿色荧光，而位于腹部裂缝的一个器官可产生橙黄色荧光。这种独特的发光甲虫是不寻常的，因为个体间可通过发光器官发出光的颜色进行区分。从腹部发光器官克隆的互补DNA链可编码4种荧光素酶，能产生绿色到橙色的荧光（544－593nm）。由于编码的荧光素酶的氨基酸序列有95－99％同源，所以发光颜色的差异仅取决于个别的几个氨基酸。 研究这些天然的荧光素酶，不仅有助于揭示颜色差异的物质基础，而且帮助我们将荧光范围扩展到红色（图1，B）。我们选择一种亮度高的发射黄绿荧光的荧光素酶作为一系列报告基因的模板。由于和萤火虫报告基因luc+ 在一起，所以删除磕头虫荧光素酶的过氧化物酶体定位序列，使报告基因在哺乳动物细胞的细胞质中表达。同时基因定点突变，增加此荧光素酶在40℃的热稳定性，与哺乳动物细胞的培养条件相匹
图1. 磕头虫(Pyrophorus sp)和克隆的萤光素酶基因的不同发光颜色，图A.从照片中可清楚地看到磕头虫头部的一对发光器官发射绿光。腹部裂缝处的发光器官发射橙黄色的光，只在飞行时发光。图B（从左至右），从磕头虫克隆的基因可发出绿色和橙色萤光，突变的发光基因产生红色萤光。
