普洛麦格中文通讯 第八期 2003
 

　

mrna Target:5＇-G1 N2 –18  C19-3＇

Complement:3＇-C1 N2-18G19-5＇

Oligonucleotides for siRNA production:

Oligo 1(top strand for sense):5＇-GGATCCTAATACGACTCACTAATA-G1N2-18C19-3＇(G1N2-18C19=sense Mrna sepuence)

Olige 2 (bottom strand for sense)3＇-CCTAGGATTATGCTGAGTGATAT-C1N2-18G19-AA-5＇

Olige 3(top strand for antisense):5＇-GGATCCTAATACGACTCACTAATA-G19N18-2C1-3＇(G19N18-2C1=antisense mrna sequence )

Oligo 4(bottom strand for antisense)：3＇-CCTAGGATTATGCTGAGTGATAT-C19N18-2G1-AA-5＇                        

Oligonucleotides for Hairpin siRNA Production:

Oligo 1 (top strand for hairpin):5＇-GGATCCTAATACGACTCACTAATA-G1N2-18C19(sense)-TTCAAGAGA(loop)-G19N18-2C1(antisense)-3＇

Oligo 2 (bottom strand for hairpin):3＇-CCTAGGATTATGCTGAGTGATAT-C1N2-18G19(sense)-AAGTTCTCT(loop)-C19N18-2G1(antisense)-AA-5＇  

　

图3.产生siRNA 或发夹siRNA的模板所需要的DNA寡聚核苷酸。靶mRNA的正义序列被认为是蛋白编码序列。

　

　

图4：比较用化学合成的或用T7 RiboMAXTM Express RNAi 系统提外合成的三种不同的海肾siRNA对海肾荧光素酶表达的抑制程度。将针对hRluc mRNA三个不同位点的siRNA各20ng转染稳定表达优化密码子的海肾荧光素酶基因（hRluc）的CHO细胞。另外，对相同3个位点的体外合成的shRNA也进行检测。用一种“杂乱”siRNA作为阴性对照，用化学合成的siRNA作为阳性对照（Dharmacon）。采用siLentGeneTM Transfection Reagent在96孔板中进行转染，每种siRNA转染8个复孔。转染后24小时，4个孔用海肾荧光素酶分析系统分析hRluc的活性，4个孔用CellTiter-Glo® 发光细胞生存分析系统检测细胞的数目。对每种siRNA的转染，计算平均hRluc信号与平均CellTiter-Glo® 信号的比值，并计算该比值与阴性对照组该比值的差值。图中显示的数据是与“杂乱”siRNA的转染相比，海肾hRluc信号/CellTiter-Glo® 分析信号之比值下降的百分比。D=从Dharmacon化学合成的siRNA；P=用T7 RiboMAX(tm) Express RNAi 系统体外转录的siRNA；HP=用T7 RiboMAXTM Express RNAi 系统体外转录的shRNA。所有体外合成的siRNA和shRNA用技术手册TB316介绍的技术进行合成和纯化，并在2.5%琼脂糖/1×TAE凝胶上进行定量，用已知量的化学合成的siRNA作为对照。电泳后凝胶用1:10,000 SYBR(r) Green Ⅱ（Molecular Probes）染色20分钟，而后用Molecular Dynamics Storm(r)荧光扫描仪进行扫描定量（blue mode; PMT=1,000）

结 论

    T7 RiboMAXTM  Express RNAi 系统可快速、有效合成siRNAs或shRNAs，从而进行哺乳动物RNA干扰的研究。一般是每毫升反应体系可产生1－2mg siRNA或shRNA。该系统的唯一要求是用包含目的序列的dsDNA为模板。体外合成方法简单，可对单一靶点产生多种siRNA，从而可快速合成和筛选对靶蛋白高度抑制的siRNA。

　

图5：内源p53蛋白的抑制。将293T细胞接种到12孔板上，24小时后采用siLentGeneTM转染试剂转染 200ng“杂乱”siRNA (泳道1)，200ng体外合成的p53 siRNA (泳道2)，或200ng化学合成的p53 siRNA (泳道3)。转染后24小时，用含有蛋白酶抑制剂的1×Reporter Lysis Buffer（产品目录号：E3971）裂解细胞，并用BCA Protein Assay (Piece)进行蛋白定量。取相同量的裂解液（10μg）在4－12％聚丙烯酰胺Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上电泳分离，并转到Hybond®-C膜上。用p53抗体（Calbiochem）和β-actin（Abcam）抗体进行杂交。采用山羊抗鼠HRP二抗及TranscendTM Chemiluminescent Non-Redioactive Translation Detection System（产品目录号：L5080）化学发光检测试剂进行检测。杂交膜用Kodak X-OMAT®胶片曝光4分钟。另外，同时检测β-actin蛋白以控制上样量和转膜过程。图中标出了p53和β-actin的条带，分子量大小与预期的一致。

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