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目的序列的选择
基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。以下所述几条对于shRNA设计的成功极为重要。
● 选择跟有AA序列的29个碱基，正义链和反义链都采用这29个碱基(不包括AA重复)来设计寡核苷酸。
● 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
● ShRNA序列的GC含量应为40%-50%左右。
● 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
寡核苷酸的设计
● 通常克隆在shRNA表达载体中的shRNA包括两个由一茎环序列分隔的反向重复序列，随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。
● 两个互补的寡核苷酸需带有5'BamHI和3'XbaI接头。
● Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。 |
