方法
人血浆 血浆样本用 HiTrap™ Blue和HiTrap™ ProteinG柱去除白蛋白和IgG。流出产物进行变性(GUA-HCl), 还原(PlusOne™ DTT), 烷基化 (Iodoacetic acid)和消化(Ettan™ Trypsin)。将样品等分后,加入消化的马脱辅基红蛋白,浓度分别为 100和500 fmol。
得到的多肽混合物使用配有纳升-喷雾界面的Ettan MDLC™ (GE Healthcare)连接Finnigan LTQ™(Thermo Electron Corp.) 通过RPC nanoLC-MS/MS进行分析。全扫描的质谱谱图以profile模式收集,MS/MS谱图以centroid模式收集。检测,强度谱图比较和定量是通过DeCyder MS prototype软件以全自动模式对全扫描前体质谱谱图分析得到的。通过在MS/MS谱图和TurboSEQUEST中的信息进行多肽识别。
小鼠脑组织 在胚胎干(ES)细胞中通过同源重组NDST-1基因被破坏。带有被破坏基因的细胞随后经显微注射到宿主胚泡中。 嵌合胚泡被转移到孕育母体中并在其中发育成为小鼠,在它们的生殖细胞中带有破坏了的基因。通过这些小鼠的杂交,产生所有基因型的单独个体。
小鼠脑样本(3个对照样本和3个NDST-1缺失样本) 被匀浆和离心。干扰的非蛋白物质被去除 (Ettan 2-D Clean-Up Kit),随后进行胰蛋白酶水解。
分析和评估与人血浆样本相同。
小鼠脑样本的实验设计和评估。
大鼠胰岛瘤细胞 从四个大鼠胰岛瘤细胞培养皿中收集培养物,两个用forskolin处理,两个对照。这些样品被分成两组四个相同的混合物,经过样品纯化和浓缩没有经过酶解,样品被用通过一个nano-spray界面与LTQ-FT (Thermo Electron Corp.) hybrid质谱连接的RPC nano-LC (Michrom Paradigm MS4)分离解析。
评估与人的血浆样本相同。
线性 8种蛋白的混合物(总量为1 pmol/ml)被用蛋白酶消化。把样品分成几份后,加入四种多肽 (Angiotensin III, Sustance P, Fibrinopeptide B, ACTH 1-24),浓度范围从10 fmol 到10 pmol.
分析和评估与人的血浆样本相同。 |