功能基因组学 

用LC-MS/MS数据在哺乳动物样品中对蛋白和多肽标志物进行鉴
别和定量的全自动方法
Harald Pettersen1; David Fenyo1; Staffan Lindqvist1; Steven Taylor2, Nancy Andon2; Jim Bilakovics2; Lennart Bjorkesten1
1GE Healthcare Bio-sciences, Uppsala, Sweden; 2Amylin Pharmaceuticals, San Diego, CA, USA


方法
人血浆 血浆样本用 HiTrap™ Blue和HiTrap™ ProteinG柱去除白蛋白和IgG。流出产物进行变性(GUA-HCl), 还原(PlusOne™ DTT), 烷基化 (Iodoacetic acid)和消化(Ettan™ Trypsin)。将样品等分后,加入消化的马脱辅基红蛋白,浓度分别为 100和500 fmol。
  得到的多肽混合物使用配有纳升-喷雾界面的Ettan MDLC™ (GE Healthcare)连接Finnigan LTQ™(Thermo Electron Corp.) 通过RPC nanoLC-MS/MS进行分析。全扫描的质谱谱图以profile模式收集,MS/MS谱图以centroid模式收集。检测,强度谱图比较和定量是通过DeCyder MS prototype软件以全自动模式对全扫描前体质谱谱图分析得到的。通过在MS/MS谱图和TurboSEQUEST中的信息进行多肽识别。
小鼠脑组织 在胚胎干(ES)细胞中通过同源重组NDST-1基因被破坏。带有被破坏基因的细胞随后经显微注射到宿主胚泡中。 嵌合胚泡被转移到孕育母体中并在其中发育成为小鼠,在它们的生殖细胞中带有破坏了的基因。通过这些小鼠的杂交,产生所有基因型的单独个体。
  小鼠脑样本(3个对照样本和3个NDST-1缺失样本) 被匀浆和离心。干扰的非蛋白物质被去除 (Ettan 2-D Clean-Up Kit),随后进行胰蛋白酶水解。


分析和评估与人血浆样本相同。

小鼠脑样本的实验设计和评估。
大鼠胰岛瘤细胞 从四个大鼠胰岛瘤细胞培养皿中收集培养物,两个用forskolin处理,两个对照。这些样品被分成两组四个相同的混合物,经过样品纯化和浓缩没有经过酶解,样品被用通过一个nano-spray界面与LTQ-FT (Thermo Electron Corp.) hybrid质谱连接的RPC nano-LC (Michrom Paradigm MS4)分离解析。
  评估与人的血浆样本相同。

线性 8种蛋白的混合物(总量为1 pmol/ml)被用蛋白酶消化。把样品分成几份后,加入四种多肽 (Angiotensin III, Sustance P, Fibrinopeptide B, ACTH 1-24),浓度范围从10 fmol 到10 pmol.
  分析和评估与人的血浆样本相同

 

结果和讨论

强度图显示在一个血清样品中保留时间相对于质荷比的关系。左图:整个数据组,其中标出3个肌球素多肽的检测到的电荷状态 (参见表格)。右图:强度图的放大部分,显示在大峰之中检测到的一个小峰。   分别加入100和500fmol肌球素的样品之间比较得到的p < 0.001的多肽。Intensity maps: 该多肽在其中被检测到的强度图数目。rt (min): 平均保留时间(括号中显示标准偏差;n=8). t-test: students t-test得到的p值。p值最小的三个多肽经证明是来源于肌球素。

DeCyder MS prototype软件得到的峰图显示从FT数据在得到的胰岛素,15+离子。左图:强度图。右上图:发现的和理论的(黑线)同位素公布。右下图:三维图像

胰岛素的定量结果,采用从未处理细胞培养物来源的四个样品混合物作为对照组和从forskolin刺激的细胞培养物来源的四个作为处理组。胰岛素上调大约66%。误差条表示标准误差。Ubiqultin被显示作为内标


加入样品的量的图与从自动检测/比较得到的加入多肽峰强度比较。Angiotensin lll 在10fmol的峰被干扰,这很容易通过一个动态链接到信号强度图(小图)而被确认。

 

强度图显示小鼠脑样品中保留时间相对于质荷比的关系。在6个强度图中的每一个检测到大约1000个多肽(未使用背景扣除)。把6个强度图匹配可以计算P值。(也就是在每个实验组中从2个以上强度图得到的数据是可用的)。这些匹配中的20个的P值小于0.01。


 

 
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