文献参考

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经Perfectprep DNA Gel Cleanup 试剂盒回收的DNA
的限制性消化实验

琼脂糖凝胶电泳广泛地用于分离和分析DNA,随后这些DNA用于其它的实验中。Eppendorf公司的 Perfectprep® Gel Cleanup凝胶回收试剂盒可以从琼脂糖凝胶中纯化不同大小（70 bp – 10 kb）的DNA片段，其回收率>70%。因为大多数从琼脂糖凝胶中提纯的DNA将用于其他的实验，所以得到高质量的DNA是问题的关键所在。纯化的DNA常用来进行限制性酶切，限制性酶对抑制因子非常敏感，所以可以很好地指示在纯化的DNA中是否含有污染物。

　　下面我们用Eppendorf公司的Perfectprep® Gel Cleanup 纯化以λ噬菌体为模板的3.49 kb PCR扩增片段，纯化后的DNA用EcoRI、EcoRV和HindIII 限制性酶消化，酶切反应作平行对照。同时，为了进行对比，用其它公司的DNA凝胶回收试剂盒纯化相同的DNA扩增片段，然后用相同的限制酶做了酶切消化。EcoRV和HindIII的酶切结果显示：用本公司试剂盒纯化的DNA酶切效果与其他公司的一样或更好一些；而在所有用EcoRI酶切的结果中，用本公司试剂盒纯化的DNA酶切效率均优于其他公司。这些表明，在限制性酶切反应中，用本试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化得到的DNA比其他公司试剂盒纯化的DNA酶切效果更好。

材料

λ噬菌体DNA（25ng/ml）(NEB)
SeaKem LE Agarose (BMA)
OmniPur Agarose (EM Science)
1XTBE (Eppendorf)
溴化乙锭　10mg/ml (Sigma)
Mastercycler Gradient (Eppendorf)
Perfectprep® Gel Cleanup Kit　(Eppendorf)
其他公司 DNA凝胶回收试剂盒
限制性内切酶：EcoRI　EcoRV　HindIII (NEB)

方法

PCR1:
3.49kb的λDNA片段是使用下列Eppendorf试剂从9630ml的PCR反应中扩增得到的。（括号里的数值代表反应体系中试剂的总量或者终浓度）。
模板DNA （50 ng）
10xTaq DNA 聚合酶反应缓冲液（1X）
dNTP混合液（0.2mM）
25mM MgCl2(0.5mM)
10mM dNTP混合液（0.2mM）
Taq DNA聚合酶（0.05U/ml）
分子生物学级别的水

引物：
10 mM JMF1
5’-AAA-AAC-GTC-CGA-GAC-GAA-T-3’(0.1 mM)
10 mM JMrev3.6
5’-TCA-GCA-TGT-AGC-ATG-CAA-CC-3’(0.1 mM)
Integrated DNA Technologies (IDT)

λDNA使用MasterCycler gradient采用以下的循环条件扩增：
94 °C 5 分钟
94 °C 45 秒
70 °C 20 秒 35 个循环
72 °C 2 分钟

72 °C 5 分钟
10 °C 保持
扩增之后合并样品。

凝胶电泳：
20 mlPCR产物被加到100ml，1%含2ml 10mg/ml溴化乙锭的SeaKem LE琼脂糖凝胶上样孔中，于1xTBE缓冲液中，以117伏电压电泳30分钟。