文献参考

Eppendorf TripleMaster PCR System	Human RB gene (180 bp)	Human apo E gene (268 bp)	Human MC1R gene (760 bp)
Tuning Buffer with Mg²⁺	1.6 x ; 4.0 mM	1.6 x ; 4.0 mM	1 x ; 2.5 mM
DMSO	5%	5%	2%
dNTP's	200 mM each	200 mM each	200 mM each
Primers	0.4 mM each	0.4 mM each	0.4 mM each
TripleMaster enzyme mix	2.0 units	2.0 units	2.0 units
Template DNA	100 ng	100 ng	100 ng

Invitrogen ThermalAce DNA Polymerase Kit	Human RB gene (180 bp)	Human apo E gene (268 bp)	Human MC1R gene (760 bp)
ThermalAce Buffer with Mg²⁺	1 x ; 1.5 mM	1 x ; 1.5 mM	1 x ; 1.5 mM
dNTP's	200 mM each	200 mM each	200 mM each
Primers	0.4 mM each	0.4 mM each	0.4 mM each
ThermalAce DNA Polymerase	2.0 units	2.0 units	2.0 units
Template DNA	100 ng	100 ng	100 ng

Roche GC-RICH PCR System	Human RB gene (180 bp)	Human apo E gene (268 bp)	Human MC1R gene (760 bp)
GC-RICH PCR Buffer with Mg²⁺ and Dmso	1 x ; 1.5 mM ; 5%	1 x ; 1.5 mM ; 5%	1 x ; 1.5 mM ; 5%
GC-RICH Resolution solution	0 - 2 M	0 - 2 M	0 - 2 M
dNTP's	200 mM each	200 mM each	200 mM each
Primers	0.4 mM each	0.4 mM each	0.4 mM each
GC-RICH PCR enzyme mix	2.0 units	2.0 units	2.0 units
Template DNA	100 ng	100 ng	100 ng

实验结果1

　　三个系统均可扩增出大小为268bp的apo E 基因片段，但是TripleMaster系统的产量最高（Figure 1）。Invitrogen 和Roche 系统的产量相近。 Roche公司在不含GC-RICH Resolution

Solution和含0.5M GC-RICH Resolution Solution时都获得了扩增片段，1.0M, 1.5M, 2.0M 浓度的GC-RICH Resolution Solution 没有扩增出来任何产物(结果未示)。

　　Invitrogen 和TripleMaster

系统扩增的180 bp RB基因片段的产量差不多（见Figure 1），但是，Invitrogen系统还扩增出一些非特异产物。 Roche 系统在所有浓度下的GC-RICH ResolutionSolution中都没有扩增出条带 (结果未示)。

实验结果2

　　TripleMaster系统在最初的热循环条件下虽然扩增出高产量的760 bp MC1R 基因片段，但同时也扩增出一些非特异的片段（Figure 2）。当采用Touchdown PCR

方法时，三种系统均只扩增出高产量的特异的760 bp MC1R 基因片段。其中TripleMaster系统的产量最高，Invitrogen 和Roche 系统的产量稍低。Roche在没有添加GC－RICH Resolution Solution或者添加0.5M

或1.0 M GC－RICH Resolution Solution时能扩增出MC1R条带，但在添加了1.5 M 或2.0的GC－RICH Resolution Solution时无扩增条带（结果未示）。

讨论

　　对于模板富含GC的DNA的扩增，TripleMaster PCR系统需要使用DMSO来提高PCR的产量和反应的特异性。DMSO是一种辅助溶剂可以通过破坏碱基配对来降低DNA的稳定性，进而降低退火温度。DMSO和其它的添加剂，诸如甘油，甜菜碱或者乙酰胺都已经被证实可以提高一些富含GC的DNA序列的扩增效率，甚至对那些使用标准的PCR技术难以扩增的DNA也有作用。需要注意的是尽管这些添加剂可以增加PCR反应的产量和特异性，对于一个特异性的引物/模板来说，它们却会改变DNA的溶解温度进而影响最优的退火温度。因此，可能需要重新优化温度以及循环数等参数，导致需要补充几轮额外的实验。因此尽管TripleMaster PCR系统可以与这些辅助溶剂一起使用，但不一定都必需或有益于所有的目的基因片段及下游操作。

TripleMaster PCR系统提供了独特配方的反应缓冲液，能够使PCR反应在较低浓度的PCR添加剂下进行反应，从而可以降低与下游操作冲突的可能以及对PCR反应进行重优化的风险。

　　总之，TripleMaster 酶混合液结合了Taq酶的高效性与3’-5’外切酶的矫正耐热活性，与聚合酶增强因子一起提供了极高的延伸速率和最大程度的聚合保守。TripleMaster Tuning 缓冲液，专为长程PCR设计，也可以用来扩增短的、富含GC的目的片段。除此之外，TripleMaster高保真缓冲液也用于扩增短的富含GC的片段，也可以用于高保真的PCR反应。所有这些改进的组分都使得TripleMaster PCR系统作为一种多功能的试剂盒在扩增富含GC 的PCR反应、长程PCR反应以及高保真PCR反应中大有作为。我们可以发现，TripleMaster PCR系统是个针对不同 PCR反应要求的广泛可用的解决方案。

参考文献

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[5] TripleMaster PCR System user manual. 2000. Version TM1000, Eppendorf.
[6] Turner, S.L. and F.J. Jenkins. 1995. Use of deoxyinosine in PCR to improve amplification of GC-rich DNA..Biotechniques. 19: 48-52.

作者：Scott Tarpinian & Jennifer Halcome, Eppendorf – 5 Prime, Inc.
Andres Jarrin, Eppendorf AG