文 献 参 考

长程PCR的理想之选

（续前）表1：长程PCR的引物序列。

Primer Sequence
Factor VIII Forward 5'-ACC CAC CAG TCT TGA AAC GC-3'
Factor VIII Reverse 5'-GGT GCT CCA GGC ATT GAT TG-3'
tpA Forward 5'-CCT TCA CTG TCT GCC TAA CTC CTT CGT GTG TTC C-3'
tpA 24 kb Reverse 5'-TGT CTC CAG CAC ACA GCA TGT TGT CGG TGA C-3'
tpA 18 kb Reverse 5'-GCA GGG TCT GCA GAA CTC TGA GCT GTA CTT CC-3'

表2：PCR反应体系

Eppendorf TripleMaster Human Factor VIII gene 29 kb Human tPA gene 24 kb Human tPA gene 18 kb
Tuning Buffer 1 x 1 x 1 x
Magnesium 2.5 mM 2.5 mM 2.5 mM
dNTP's 500mM 500mM 500mM
Forward primer 0.4mM 0.4mM 0.4mM
Reverse primer 0.4mM 0.4mM 0.4mM
TripleMaster enzyem mix 2 units 2 units 2 units
Template DNA 500 ng 500 ng 500 ng

   Invitrogen ThermalAce
ThermalAce Buffer 1 x 1 x 1 x
Magnesium 1.5 mM 1.5 mM 1.5 mM
dNTP's 200mM 200mM 200mM
Forward primer 100 ng 100 ng 100 ng
Reverse primer 100 ng 100 ng 100 ng
ThermalAce DNA Polymerase 2 units 2 units 2 units
Template DNA 100 ng 100 ng 100 ng

   Stratagene EXL
EXL Buffer 1 x 1 x 1 x
Stabilizing Solution 1ml 1ml 1ml
Magnesium Not listed Not listed Not listed
dNTP's 500mM 500mM 500mM
Forward primer 200 ng 200 ng 200 ng
Reverse primer 200 ng 200 ng 200 ng
EXL DNA Polymerase 5 units 5 units 5 units
Template DNA 250 ng 250 ng 250 ng

   Roche Expand 20 kbPlus & Expand Long
Buffer 1 x 1 x 1 x
Magnesium 2.25 mM 2.25 mM 2.25 mM
dNTP's 500mM 500mM 500mM
Forward primer 0.4mM 0.4mM 0.4mM
Reverse primer 0.4mM 0.4mM 0.4mM
Enzyme mix 2.6 units 2.6 units 2.6 units
Template DNA 250 ng 250 ng 250 ng

　

　

表3：长程PCR循环温度参数

Target Cycle Temperature Time
29 kb Human Factor VIII gene 1 x 93 °C 3 min
10 x 93 °C 15 sec
57 °C 30 sec
68 °C 24 min
18 x 93 °C 15 sec
57 °C 30 sec
68 °C 24 min+20 sec
　
24 kb Human tPA gene 1 x 93 °C 3 min
10 x 93 °C 15 sec
65 °C 30 sec
68 °C 21 min
17 x 93 °C 15 sec
65 °C 30 sec
68 °C 21 min+20 sec
　
18 kb Human tPA gene 1 x 93 °C 3 min
10 x 93 °C 15 sec
65 °C 30 sec
68 °C 15 min
17 x 93 °C 15 sec
65 °C 30 sec
68 °C 15 min+20 sec

　

结  果

    　用Eppendorf公司的TripleMaster PCR系统和罗氏公司的PCR系统扩增出了所有三条长PCR产物，而用Invitrogen 和Stratagene 公司的系统没有扩增出任何的片段。并且， Eppendorf 公司的TripleMaster PCR系统扩增的PCR产物，在产量上明显比罗氏公司占有优势。图中某些样品中形成了的U形带是由于在loading buffer中含有甘油使得DNA在上样孔中泳动不同。此外，由于参比的每一种样品都使用的是相同的上样量，Eppendorf公司的样品显得过剩从而导致拖尾。这个问题由于DNA片段的长度增大而表现得更加突出。
　

讨论

    　TripleMaster PCR系统在各种情形下都能够有效的扩增出PCR片段，轻松的胜过所有的竞争对手。与之效果最为接近的是罗氏公司，也需要两套扩增系统，一套定位于扩增5－20kb大小的目的片段，另外一种系统用于扩增超过20kb大小的目的片段。然而，Eppendorf公司的TripleMaster PCR系统却可以扩增覆盖它们全部大小范围内的目的片段，因此科研工作者只需要购买Eppendorf公司的一种系统即可以进行所有长程PCR反应,从而节约宝贵的时间和金钱。并且，TripleMaster PCR系统含有一个简单且易于使用的操作指南，提供的是特定而不是模棱两可的反应体系中的试剂浓度，从而避免了耗时进行优化实验。同时，TripleMaster PCR系统也可用来扩增长达50 kb的目的片段，且不需要辅助溶剂以及诸如甜菜碱（betaine）和二甲亚砜（DMSO）

　

等添加成分，从而进一步简化了起始混合成分。另外，与其它同类测试系统相比，TripleMaster PCR系统在每个反应中使用的酶量最少。因此，使用TripleMaster PCR系统不仅得到的产物量最高，而且也是最经济有效的长程PCR系统。因此Eppendorf公司的TripleMaster PCR系统是长程PCR最理想的选择。

参考文献

[1] Barnes, W.M. 1994. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from l bacteriophage templates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2216-2220.

[2] Cantor, C.R. and C.L. Smith. 1999. Genomics. John Wiley & Sons, Inc., NY, pp. 106-107.
[3] Cheng, S., C. Fockler, W.M. Barnes, and R. Higuchi. 1994. Effective amplification of long targets from cloned
inserts and human genomic DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 5695-5699.
[4] Frost, M.R. and J.A. Guggenheim. 1999. Prevention of depurination during elution facilitates the reamplification
of DNA from differential display gels. Nucleic Acids Res. 15: e6.
[5] TripleMaster PCR System user manual. 2000. Version TM1000, Eppendorf.

 作者：Scott Tarpinian , Eppendorf – 5 Prime, Inc.
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