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交 流 论 坛 欲速则达——FastPlasmid means faster and successful
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抽提质粒DNA，是我们在实验室里几乎每天都要面对的工作，其操作过程比较繁琐，需要花费大量的时间。尤其是当获得的质粒DNA不符合实验要求，需要重新抽提的时候，大家的心情就会特别沮丧。最近，Eppendorf公司推出了一种新型质粒DNA抽提系统-FastPlasmid试剂盒。经过使用，我们感到该试剂盒确实达到了事半功倍的效果。 使用该试剂盒，只需要一种溶液、一步就可以裂解细胞，溶解细胞各组分，并且释放出质粒DNA。经过短暂离心，质粒DNA从裂解液中分离，吸附于滤膜上，然后可被洗脱下来。整个过程还不到10分钟。与传统的碱法相比，这种新型质粒DNA纯化的方法减少了操作步骤，因此花费的时间少了很多，但是得到的DNA的数量和质量完全可以满足我们下一步实验的要求。 材料和方法 材料： 液体LB培养基+0.2mg/ml 氨苄青霉素,宿主菌DH10B,pACT2载体(根据pGADT7载体改造而来)+约1KB插入片段 方法: 1、将3mlLB液体培养基加入试管中，分别接入三个不同克隆，37°C剧烈振摇过夜。 2、用Eppendorf Centrifuge 5810R台式冷冻离心机4000 rpm 5min收集菌体，弃上清，吸干残留液体。 3、加入400 ml 预冷过的，悬浮沉淀荔枝体转移到离心管中，混合后的需保存在0-4°C 。 4、用振荡混匀仪充分混合菌液30s。 5、室温反应（裂解）3min。 6、将反应后（裂解）的菌液转移到装在Wash Tube中的Spin Column中。 7、高速离心30-60s。 8、加入400 ml DILUTED Wash Buffer。 9、高速离心30-60s。 10、取出Spin Column，轻轻倒出洗液，再将Spin Column放回Wash Tube，高速离心1min。 11、将Spin Column移入收集管。 12、在Spin Column中加入60 ml 水。 13、高速离心30-60s。 14、得到的质粒用Eppendorf BioPhotometer测定浓度和纯度。 结果 1、用FastPlasmid制备的质粒DNA的分光光度计分析和电泳分析结果 本来按照eppendorf提供protocol，培养液只需要105ml，但是实际操作下来，发现针对pACT2载体和DH10B宿主菌的组合，1.5ml培养液质粒得率较低。因此我们把培养体积扩大到3ml。3个质粒分别命名为pACT2A1,pACT2A2,pACT2A3 。 |
得到的DNA量和纯度见表一，电泳图谱见图一：
2、用FastPlasmid制备的质粒DNA测序结果 质粒送出测序峰图见图二（完事峰图较长，由于版面限制，特截取测序反应比较靠后的峰图）：
图2 pACT2载体插入片断DNA测序结果峰图截取（ABI PRISM 3700 DNA测序仪） 讨论 在使用试剂盒的过程中，我们觉得该试剂盒主要具有以下两个优点：1、耗时少。与其它碱法试剂盒相比，一般情况下，使用FastPlasmid可以节约一半的时间。2、纯度高，得到的质粒DNA的OD260/280比值基本上都在1.8左右，而且一般都为超螺旋形式存在（见图1）。 尤其是第二个特点，即获得的质粒DNA纯度较高，确实给我们的实验带来了很大的方便。因为我们一般都需要将质粒DNA送去测序，而质粒DNA的纯度很大程度上决定了测序结果的好坏。很多质粒用原来的试剂盒制备后几次测序都无法得到结果，而同样的质粒换用FastPlasmid制备则顺利地得到了良好的测序结果，每个反应基本上都可以达到605bp以上仍然保持良好峰型。从图2中可以看到，反应的峰型比较锐利，而且基本上未见明显基峰。 虽然FastPlasmid试剂盒的价格稍高于国产试剂盒和一些进口试剂盒，但是考虑到每个测序反应的价格高于质粒制备的成本。如果一次测序即可获得成功，与反复抽提质粒DNA并反复测序相比，即使使用价格稍高的核酸纯化试剂盒，仍然可以从总体上节省开支。更为重要的是，一次测序即获得成功还大大加快了实验进程。 质粒DNA纯度高，还有助于在实验中较准确地定量，对于实验结果的稳定和可重复性有很大帮助。同时，如果质粒DNA纯度不高，用小抽的质粒DNA直接转染细胞时，对转染效率会有较大影响。而用FastPlasmid Midi Kit制备的质粒DNA转染细胞的效果就比较好。 中国有句俗话“欲速则不达”，但是Eppendorf的 FastPlasmid试剂盒否定了这个规律。做到了欲速则达。我们期待着Eppendorf公司继续推出颠覆传统的成功产品。 作者 上海睿星基因技术有限公司酵母筛选部 单敬轩 |
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