图1. 活细胞底物的结构特点。A.EnduRen™活细胞底物在细胞中转化为海肾萤光素酶的底物--腔肠萤光素-h。ViviRen™活细胞底物也发生相似的转变，成为腔肠萤光素-h（未显示）。B. EnduRen™及ViviRen™活细胞底物的结构。
   

这一目的可以通过使用CellTiter-Glo™试剂测定总ATP方法确定活细胞数量而轻易达到。另一种归一化方法是使用能够连续表达可发出红光的萤光素酶对照质粒的共转染，例如含有Chroma-Luc™萤光素酶的pCBR-Basic载体（Cat.#E1411）或pCBR-Control 载体（Cat.#E1421）。

　　将活细胞底物与CellTiter-Glo® 试剂联合使用意味着向同一样品中加入两种试剂。首先加入ViviRen™或EnduRen™底物并测定活细胞中的海肾萤光素酶的含量。第二步，向样品中加入CellTiter-Glo®试剂，裂解细胞，产生ATP依赖的萤火虫萤光素酶的发光信号。CellTiter-Glo®试剂有效地消除海肾萤光素酶的发光信号及其它不依赖酶的发光信号，这可能是由样品反应中残留的腔肠萤光素-h产生的发光。以最极端的情况为例，将60μM的腔肠萤光素-h与2x10-12mol纯化的海肾萤光素酶（比大多数制备的细胞中的酶多1,000倍以上）共同作用，加入CellTiter-Glo®试剂后，上述反应体系中产生的发光及自发光强度可以被淬灭107,000±10,900倍。残留的发光只相当于CellTiter-Glo®试剂及加10%血清的DMEM培养基（无细胞）产生的发光的56%±4.7%，因此低于此环境中细胞产
  

生的发光水平。

　　将活细胞底物与原位结合甲壳虫萤光素酶检测方法相迭加，测定信号时需要使用带有分离波长作用的滤光片的发光光度计。红色Chroma-Luc™萤光素酶产生的发光在611nm处有最大强度，而海肾萤光素酶产生的发光在488nm处有最大强度（图5A）。如此大的光谱差异可以使用适当的红色及蓝色滤光片对同一样品进行双信号测量。

　　活细胞底物可与其它检测试剂盒相迭加的特性可以用以下的实验证明：海肾萤光素酶的表达由CRE反应元件做为启动子来控制，红色的Chroma-Luc™萤光素酶表达由组成性的SV40启动子控制。向细胞中加入EnduRen™底物及甲壳虫萤光素后，可以测定细胞的CRE应答，而用活细胞数量进行校正（图5）。与预期一致，以内参照进行校正降低了实验数据的相对误差。如图5B所示，当使用相同孔中的Chroma-Luc™发光对海肾化学发光进行校正后，经过计算的诱导相对误差从43%下降到24%。