摘 要
　　ViviRen™及EnduRen™活细胞底物已经被开发出来，这使得检测活细胞中的海肾萤光素酶比以前使用腔肠萤光素及腔肠萤光素-h做为底物的检测方法更为简单和灵敏。ViviRen™底物产生非常强的萤光，至少比腔肠萤光素亮3倍，而EnduRen™底物产生非常稳定的萤光，可以在温育24小时或更长时间后进行多次检测。两种活细胞底物均可以与CellTiter-Glo®试剂联合使用，对活细胞数量进行校正。也可以选择Chroma-Luc™红色萤光素酶来校正活细胞数量或转染效率。

简 介
　　科研工作者一直致力于在对活细胞施加的影响尽可能小的前提下监测细胞活性。但是，对于大多数细胞报告基因系统而言，需要完全破坏细胞才能够得到准确而可信的测量结果。海肾萤光素酶是一个值得注意的例外，因为它的底物、氧和腔肠萤光素对细胞无毒，并且可以即刻渗透进细胞膜。然而，腔肠萤光素的水溶液不稳定，在通常的细胞培养条件下使用起来非常困难不便。EnduRen™及ViviRen™活细胞底物专为克服这些困难而设计，而且可以与其它发光检测方法联合使用以确定活细胞的数量。

 增加活细胞底物的稳定性
　　 EnduRen™和ViviRen™活细胞底物以腔肠萤光素-h的核心结构为基础，腔肠萤光素-h是一种腔肠萤光素的高效类似物，后者经常被用于细胞发光检测。以前，以腔肠萤光素为基础的化合物使用起来十分困难，因为它们在用于维持活细胞的液态环境中不稳定。例如，37℃时在含有10%的胎牛血清的细胞培养基中，腔肠萤光素-h 的浓度在25分钟内下降50%。腔肠萤光素的浓度在这种环境中下降得更快，在大约17分钟内下降50%（1）。自身氧化是腔肠萤光素和腔肠萤光素-h浓度下降的原因之一。自身氧化的影响有两个方面，它产生萤光背景，进而降低检测灵敏度。

　　EnduRen™和ViviRen™活细胞底物的氧化位点用多酯或氧甲基乙醚进行保护。保护基团将活细胞底物的半

衰期提高到5-11小时（1-3），而未受保护的腔肠萤光素底物的半衰期仅为17-25分钟。一旦进入活细胞，酯酶及脂酶将保护基团从活细胞底物上切除，产生能够被细胞内海肾萤光素酶利用的腔肠萤光素-h（图1）。细胞培养基中游离的腔肠萤光素-h的低浓度，使自身背景发光降低了10到100倍，因而提高了发光信号的信噪比（图2，A及B）。

 活细胞底物的差别
　　 EnduRen™和ViviRen™活细胞底物都支持海肾生物发光，但是发光信号的特征却差别巨大。ViviRen™底物产生非常亮但半衰期短的萤光信号。在图2示例中（图2C），ViviRen™底物的最大萤光强度大约比腔肠萤光素的光强3倍。ViviRen™底物自发萤光的大幅度降低使其信噪比值比腔肠萤光素提高288倍。较低的自发光是ViviRen™及EnduRen™活细胞底物的重要特点。

　　ViviRen™底物产生明亮的萤光，而EnduRen™底物则产生半衰期更长的萤光。酯酶从EnduRen™底物切除氧甲基乙醚的速度比它们从ViviRen™底物切除酯基的速度要慢许多。（图1中的结构，酯酶的数据未示出）。较低浓度的腔肠萤光素-h产生的发光信号强度较低，但更加稳定。因此，EnduRen™底物产生的发光信号可以稳定24小时。在通常情况下，ViviRen™底物产生的最初发光信号至少是EnduRen™底物的20倍，但是大约45分钟以后，EnduRen™底物的发光信号就与ViviRen™底物的发光信号强度相当（图3）。EnduRen™底物产生的发光信号的超稳定性可以实现对单个样品进行多次测量。例如，只要加入一次EnduRen™底物，就可以在转染干扰海肾萤光素酶的siRNA 后33小时之内对CHO细胞中海肾萤光素酶稳定表达的抑制作用进行测定（图4）。

　　我们已经证明，与细胞样品和腔肠萤光素共同孵育、细胞样品和载体共同孵育或未经处理的情况相比，推荐量的ViviRen™及EnduRen™活细胞底物浓度及作用时间对CHO, HeLa, HEK 293 或NIH/3T3细胞株无毒性（2，3）。

将活细胞底物与细胞活力检测方法联合使用
　　 细胞中的海肾生物发光检测可以与细胞活性测定一同进行，从而对报告基因活性进行活细胞数量的归一化。