图 2. GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System 操作步骤概述
用了若干参数，包括检查反义序列5'末端的自由能，评估siRNA候选目标位点等。虽然siRNA Designer 可选择有效的潜在siRNA序列，但是不能保证选中序列都将会高度有效。还必须进行实验测试最佳序列，以确保实现高度抑制作用。psiCHECK™ 载体 (Cat.# C8011,C8021)，能够监测与报告基因融合的待研究的基因序列表达的变化，从而提供一个有用的筛选工具，实现快速测试siRNA序列抑制目标基因表达的效率(5)。
发卡克隆
一旦选定了目标位置，将合成的发卡寡核苷酸退火并插入pGeneClip™ 载体，然后筛选克隆质粒(图2)。这两个寡核苷酸形成的DNA插入物包含一个发卡siRNA目标序列。寡核苷酸的常规脱盐处理是必需的，但是凝胶纯化和5'磷酸化过程却不是必需的。因为插入载体的寡核苷酸很短（～60nt），常规琼脂糖凝胶电泳识别可能很困难。为了使插入物的识别变得更为方便，在载体骨架中设计了一个Pst I酶切位点（图2）。在退火的寡核苷酸成功插入载体后，会形成第二个Pst I位点。用Pst I消化后，可产生两个容易分离的、大小分别约为3 kb和1 kb的DNA条带。如果没有插入物存在，Pst I消化后将会形成一个单一带。在我们所做的实验中，含有寡核苷酸插入片断的克隆菌数目比载体自连的克隆菌数目高50多倍。此外，Pst I消化显示超过90%的菌落包含插入物。
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图3. 以U1为基础的pGeneClip™ 和以U6为基础的psiSTRIKE™ Basic载体的海肾（Renilla）萤光素酶的瞬时抑制效果。pGeneClip™ 和psiSTRIKE™ Basic 载体包含非特异性shRNA（NS）或海肾（Renilla）萤光素酶-特异的shRNA，被转染进HeLa细胞，以稳定地表达海肾（Renilla）萤光素酶。每个载体系统独立进行转染。在转染48小时后，EnduRen™ 活细胞底物（Cat.# E6482）被添加到反应体系中，以测定海肾（Renilla）萤光素酶的活性。用CellTiter-Glo® 试剂（Cat.# G7571）测定细胞活力。图A，将海肾（Renilla）萤光素酶活性相对于细胞活力进行归一化。图B，以海肾（Renilla）萤光素酶特异的shRNA转染组的发光强度除以非特异性对照组的发光强度，得出抑制率。
瞬时抑制作用
在瞬时抑制分析中，我们比较了siSTRIKE™ U6 Hairpin Cloning System （以U6 启动子(6)为基础）与GeneClip™系统的效果。同样的能干扰海肾（Renilla）表达的shRNA目标序列被克隆到 pGeneClip? 和 psiSTRIKE™ -Basic载体，并转染能稳定表达海肾（Renilla）萤光素酶的HeLa细胞系（图3），结果观察到的抑制水平相似。在多次重复实验中， 基于U1 和 U6的系统对海肾（Renilla）萤光素酶的抑制水平都超过了70%。这些结果表明，在siRNA实验中，U1启动子与U6启动子的功效相当。
我们在几种类型的细胞中测试了 pGeneClip™ -Basic载体，以确定在这些细胞系中U1是否具有DNA介导的RNAi活性。将可同时表达海肾（Renilla）和萤火虫萤光素酶活性的psiCHECK™-2载体与pGeneClip™- Baisc 载体共转染，该载体编码有海肾（Renilla）萤光素酶的干扰shRNA或非特异性对照序列。由U1启动子表达的shRNA可以抑制海肾（Renilla）萤光素酶在多种不同细胞系中表达，包括HeLa,293T,PC3,K562,HCTll6和HEC 592 |