摘要
　　在RNA干扰(RNAi)实验中，GeneClip™ 发卡克隆系统能够用于短发卡RNAs(shRNAs)的克隆和表达。该系统包含线性化载体，这类载体的结构有助于克隆出与U1启动子下游序列互补的寡核苷酸。将包含这些克隆序列的pGeneClip™ 载体转染细胞时，shRNA在细胞中产生，通过RNAi机制，导致目标基因表达的减少。在这篇文章中，我们举例说明了如何使用GeneClip™ 系统抑制多种细胞系的海肾（Renilla）萤光素酶的表达，以及瞬时或稳定转染时，对p53表达的抑制作用。

简介
　　 研究人员现在能够通过沉默基因的表达来研究蛋白质的功能。多年来研究人员一直在寻找一种有效的方法来抑制特定目的基因的表达。RNA干扰（RNAi）可以用于实现这种抑制，该发现是令人兴奋的细胞生物革新之一，而且 RNAi 技术正飞速发展。RNAi 最令人兴奋之处在于，它是真核细胞中一个自然发生的过程。研究人员能利用这一自然发生的通路，来减少某些特定基因产物表达的目的。

　　在RNAi过程中，dsRNA被一个RNaseⅢ家族成员（如DICER）识别，并被剪切为21-23bp的核苷酸片段。这些siRNA被组合进一个RNA诱导的抑制复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。在RISC复合物中，siRNA双链结构被展开，产生单链siRNA，后者会定位于与之互补的mRNA，使其被剪切，最终导致蛋白质产物的减少。使用一个U1启动子，引发RNAi效应，在体内实验中该启动子可被RNA聚合酶II（Pol II）所识别，从DNA模板上转录短发卡RNAs（shRNAs）(1)。不像其它Pol II启动子，U1启动子没有TATA盒，而是使用远端和近端序列元件将RNA聚合酶定位到启动子区域。U1启动子也有一个特定的RNA终止子（图1）。大多数其它Pol II转录产物缺乏明确的RNA终止子。这个终止子可表达出特定长度的shRNA。

图 1. U1 启动子构成。在转录起始位置之前，U1启动子区域内还包含一个远端序列元件（DSE）和一个近端序列元件（PSE），将转录因子定位到启动子区域，二者都是必需的结构。它还含有一个特定的终止信号（TERM），该区域可使得mRNA转录产物在固定位置被剪切。

GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System
　　为在体内实验中表达shRNAs，我们设计了GeneClip™U1 发卡克隆系统，用来迅速和有效地对发卡序列进行克隆。凭借明确的终止子，U1启动子可以很方便地生成shRNA，在DICER复合物裂解掉发卡上的环后，模仿在体内环境中生成siRNA。使用GeneClip™ 系统，由使用者提供的互补寡核苷酸被退火，再克隆到预消化载体的U1启动子下游。线性化载体带有5’突出末端以提高克隆效率。GeneClip?系统有5种形式提供。GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System - Basic是为感兴趣的基因的瞬时抑制而设计。GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System - hMGFP包含来自Montastrea Cavernosa 的绿色荧光蛋白基因，因此可以用于确定转染效率。通过荧光激活细胞分类技术(FACS®)，它还可以分离转染细胞。剩余的三种 GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System 使用新霉素、潮霉素或嘌呤酶素的筛选基因，具有选择稳定转染细胞的能力，所以实验结果不依赖转染效率。

目标位置选择
　　长链dsRNA导入哺乳动物细胞会诱发强烈的干扰素反应，导致蛋白质合成的完全停止和细胞死亡。短dsRNA 分子 （<30 nt）能避免该干扰素反应，并依然在RNAi通路中发生作用(2)。因为整个mRNA序列不能够在哺乳动物的细胞中使用，因此在RNAi实验中，必须选择各种不同的目标位点。然而，并不是mRNA的全部目标序列都可以同样有效地抑制目的基因的表达。siRNA Designer （www.promega.com/siRNADesigner/）是由promega研制的一个在线工具，用来辅助选取RNAi最有可能的目标位置(3，4)。使用者输入要研究的序列，程序会自动生成最有可能有效的一系列目标位置的列表。siRNA Designer 使用了若干参数，包括检查反义序列5'末siRNA Designer 使