图4. GeneClip™ U1 发卡克隆系统在各种不同细胞系中的效力。图中给出的细胞系是用psiCHECK™-2载体和 pGeneClip™ Basic载体转染的，它们包含一个非特异性或海肾（Renilla）萤光素酶特异的shRNA。使用双萤光素酶报告基因分析系统（Dual-Luciferase® Reporter 1000 Assay Syatem，Cat.# E1980）对海肾（Renilla）和萤火虫萤光素酶的活性进行测定。图中给出了海肾（Renilla）萤光素酶表达抑制的百分比。此为每个细胞类型的单一实验结果。
等人类细胞系，以及NIH/3T3和MC5鼠细胞系，以及CHO仓鼠细胞系(图4)。
为更进一步测试 GeneClip™ U1 启动子的效力，我们监测了靶定p53mRNA后，p53蛋白水平的下降状况。最初的shRNAs靶定p53的测试是在HeLa细胞中进行的，使用psiCHECK™-2载体，在该载体的海肾（Renilla）萤光素酶基因的3'端克隆进p53基因（TP53）。使用克隆了shRNAs的 pGeneClip™ - Baisc载体，对海肾（Renilla）萤光素酶和p53表达进行靶定。与对照相比，可观察到对每个蛋白的抑制作用高于90％（数据未显示）。为测试体内实验中p53的减少，用可表达p53 shRNA的pGeneClip™ - Basic 载体转染包含较高水平的p53的293T细胞。与非转染细胞相比，包含表达有p53 shRNA的pGeneClip™载体的细胞，显示蛋白水平有大于85％的减少（图5A）。
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图5. 瞬时转染和稳定克隆中 p53表达的抑制。将pGeneClip™ Basic 载体转染293T细胞。该载体或者包含针对p53的发卡目标序列，或者包含一个非特异性目标序列。48小时后，细胞被收集、裂解，使用BCA（Pierce）分析试剂测定蛋白含量。稳定转染实验种，293T细胞被pGeneOlip™ 嘌呤霉素载体转染，该载体或者包含一个非特异性序列，或者包含一种p53特异目标序列。在实验体系中加入嘌呤霉素，时间为7天，选择稳定转染细胞，对第4代和第11代克隆进行检测。在Western 分析中，每一泳道装加入2μg蛋白，用8%的Tris-甘氨酸凝胶分离，然后转印到硝酸纤维。使用p53 单克隆抗体（Oncogene Research 产品，Ab-2，1:1,000 稀释）和β-肌动蛋白（Abcam，AC-12，1:5,000稀释）检测斑点。使用 ECL™ Plus（Amersham）进行检测。在曝光到胶片之后，采用光密度仪进行蛋白定量。图A，在瞬时转染细胞中，shRNA对p53表达的抑制作用。图B，在第4代稳定克隆中，shRNA对p53表达的抑制作用。图C，在第11代稳定克隆中，shRNA对p53表达的抑制作用。
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