图2:HaloTag™ 蛋白与HaloTag™ TMR配基共价结合的分子模式.右上图为蛋白结构概况,在下是以网状Connolly表面模拟的配基结合部位的放大图。HaloTag™ TMR配基（红色的为功能区，桔色的为反应连接部位）。蓝色的为天冬氨酸亲核基团，与该配基共价结合。以苯丙氨酸残基（蓝色）替代催化部位（组氨酸），使得HaloTag™蛋白的催化能力失活，因为这样破坏了其水解酯类中间体最终形成稳定的共价键的能力。

如荧光染料TMR和diAcFAM，或亲和反应基团如生物素（图3）。HaloTag™配基结合到HaloTag™蛋白的速度是极快的。使用纯化的GST－HaloTag™蛋白融合的荧光偏振分析显示，体外实验中HaloTag™ TMR配基结合的速度很快，其结合动力学与实时测量的TMR－生物素结合链亲和素的动力学相似（图4）。其速度也与已报道的生物素－链亲和素的结合速度相似（4）。在技术手册 TM260描述的标记条件下，HaloTag™ TMR，diAcFAM 和生物素配基没有有可检测到的细胞毒性，对细胞形态也无不良影响。

活的和固定的哺乳动物细胞成像
　　如图5所示，表达HaloTag™蛋白的细胞被HaloTag™ TMR或HaloTag™ diAcFAM 配基标记后，荧光强度很高。与此对比，在相同成像条件下，对照细胞由于缺少 HaloTag™ 蛋白，则检测不出荧光。这些结果证明以这种方法标记细胞具有很高的特异性，同时也显示了两种配基均对活体细胞成像有效。优异的荧光信号的信噪比，使得可以在相对较低的表达水平下，检测出所表达的蛋白。

　　HaloTag™ 蛋白和与其配基之间共价结合的稳定性，使得对固定细胞的成像变得很容易。用HaloTag™ TMR 或 HaloTag™ diAcFAM 配基标记表达 HaloTag™ 蛋白的HeLa细胞。转染细胞在固定之后保持明亮的荧光(图6)。而对照细胞即使经过配基处理也没有可测定的荧光。荧光信号对细胞固定剂的耐受使得HaloTag™技术与其它免疫细胞化学技术和免疫组织化学技术共用成为可能。此外，对固定细胞成像的技术，对希望通过自动扫描技术进行大量细胞分析来说是至关重要的，比如高容量分析。

活细胞中被标记的HaloTagTM 融合蛋白的凝胶分析
　　HaloTag™ 蛋白—配基的相互作用非常稳定。荧光

图3.HaloTag™配基的结构。缩写:TMR,tetramethyl-rhodamine.diAcFAM,diacetyl-flurescein。

图4.荧光偏振(FP)分析比较HaloTag™ 配基和链亲和素-生物素实时检测。检测在Beacon 2000仪器上进行。所得数据用来计算二级速率常数（3）。Qureshi et al.(4)已报道链亲和素-生物素的速率为5.0×10⁶M^-1sec^-1 。

标记的 HaloTag™ 蛋白能与SDS样品缓冲液一起煮沸，并且经SDS－PAGE 凝胶电泳分离后，没有可测定的荧光信号损失。当需要把活细胞标记技术与SDS-PAGE及荧光成像分析技术结合在一起时，这种特性就显得尤为重要。

　　通过将瞬时表达HaloTag™蛋白的CHO-K1细胞与HaloTag™ TMR 配基一起孵育以研究结合的时间进程。通过SDS－PAGE凝胶电泳分析细胞裂解产物，结果显示了与HaloTag™ 蛋白质的分子量相当的单一荧光带。在短至5分钟的时间里，活细胞内所有有效的 HaloTag™结合位点都被标记。不过这仍然比在体外实验(图4) 中观察到的速率慢了很多。这可能预示配基通过细胞膜是限速步骤。细胞到凝胶电泳直接分析标记的HaloTag™融合蛋白的技术，可以结合其它蛋白分析方法，例如Western Blot。我们的初步数据也显示，这一方法可以成功地用于研究以HaloTag™融合蛋白为基础的翻译后修饰(如蛋白酶水解，资料未显示)。