| Promega：Georgyi V. Los, Ph.D., Chad Zimprich, B.S., Natasha Karassina, M.S., Randall Leaderish, Ph.D., Lance P. Encell, Ph.D., Rachel Friedman-Ohana, Ph.D., Monica Wood, M.S., Gediminas Vidugiris, Ph.D., Kris Zimmerman, B.S., Keith Wood, Ph.D.Promega Biosciences：Mark G. McDougall, Ph.D., Dieter H. Klaubert,Ph.D. |
摘 要
HaloTag™可互换标记技术，为针对活细胞及体外实验中进行蛋白的快速的位点特异性标记提供了新的选择。该技术的基础是HaloTag™蛋白与合成的配基间形成共价键。在生理条件下这种共价键特异性高，不可逆，形成快速，生成的复合物稳定性强，甚至在变性条件下也能如此。这种HaloTag™ 配基可以承载多种功能，包括荧光标记，亲和处理及固相吸附。HaloTag™ 配基的可互换性使得不用改变基本的遗传结构就可在不同的波长下进行细胞成像或结合新的功能团。标记的HaloTag™ 融合蛋白具有多种功能和较宽的光学检测范围。该灵活性使得研究人员可以在活细胞或固定细胞中对标记的HaloTag™ 融合蛋白进行成像和定位。同样也可用于分离和分析HaloTag™ 融合蛋白和蛋白复合物。
| HaloTag™ 配基的可互换性有助于在不同波长下成像，也可以在不改变基因序列的前提下引入新的功能 |
简 介
能否特异性地标记蛋白是揭示活细胞动力学和功能的关键（1）。然而，许多用来生成自然状态下的荧光标记蛋白并对其成像的传统方法既费时又困难，要求研究者精于蛋白质化学，能成功地将标记产物注射于细胞内。这需要高度的专业技术和设备支持（2）；另一方面，通过克隆和转染细胞获得的全程合成蛋白的技术更易于研究蛋白定位的本来面目，用基因融合技术标记蛋白的新方法使我们能够更加了解细胞的功能。这里我们详细描述了最新的HaloTag™ 可互换标记技术——一种在活细胞和体外培养条件下都可将融合蛋白有效标记的灵活系统。
HaloTag™ 可互换标记技术概述
图1提供了一个HaloTag™ 标记策略的概览。首先，将编码HaloTagTM蛋白或融合蛋白的HaloTag™ pHT2载体导入到细胞内。现已有多种标准方法，既可用于表达HaloTag™ 细胞系的瞬时转染，也可以产生表达HaloTag™ 蛋白的稳定细胞系。然后，细胞与5-25μM相应配基孵育5-60分钟。HaloTag™ 配基穿过细胞膜，与HaloTag™ 蛋白共价结合。洗掉未结合的配基后，研究人员即可按预定方案来实施他们的计划：荧光成像（活细胞成像或固定细胞成像），细胞裂解及蛋白捕获，或凝胶分析。荧光配基的可互换性使得人们可以在不改变基因序列 |
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图1.HaloTag™ 可互换标记技术概览
的情况下在不同波长下成像或结合新的功能团。HaloTag™ 可互换标记技术操作手册（HaloTag™ Interchangeable Technology Technical Manual）(TM260）给出了详细的操作流程。
HaloTag™ 可互换标记技术的组成
HaloTag™ 蛋白不具有催化能力，它是一种蛋白水解酶的遗传修饰衍生物，可与多种HaloTag™ 配基形成有效的共价结合（图2）。这种33kDa的单体蛋白可用于生成N－或C－端融合蛋白，这些融合蛋白可在多种类型的细胞中表达。由于HaloTag™ 蛋白源于原核细胞，哺乳动物细胞内不存在具有该蛋白活性的内源性蛋白。HaloTag™ pHT2载体包括：CMV增强子/启动子，可在许多细胞系内启动强烈而稳定的表达；一个嵌入的内含子，用于减少隐蔽的剪接位点；T7启动子，用于体外转录和/或翻译系统；以及SV40晚期poly A信号。
HaloTag™ 配基是一些小的化合物标签，它们能与HaloTag™ 蛋白共价结合。这些配基包含两种关键成分：1）一个通用的HaloTag™反应连接部位，其作用是启动与HaloTag™蛋白的共价键的形成;2)一个功能报告基团， |
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