图5. 表达HaloTag™ 蛋白的活细胞被HaloTag™ TMR或HaloTag™ diAcFAM配基所标记而得到的强荧光影像。A，B，E，F为瞬时转染了HaloTag™ pHT2载体的HeLa细胞，C，D，G，H为对照细胞。A到D为标记了5μM HaloTag™ TMR配基，E到H为标记了10μM HaloTag™ diAcFAM配基，均37℃孵育15分钟。使用适当的TMR和FAM滤过或透光装置，在Olympus FV500共聚焦显微镜下获得以上影像。

HaloTag™ 融合蛋白的捕获
　　使用含有亲和臂的配基，HaloTag™ 标记技术可被用来捕获哺乳动物细胞中表达的 HaloTag™ 融合蛋白。依照TM260技术手册中描述的程序，将海肾（Renilla）萤光素酶- HaloTag™ – FLAG的载体瞬时转染到CHO- K1细胞，再把该细胞与HaloTag™ 生物素配基一起孵育，对照组中无HaloTag™ 生物素配基。各组细胞裂解物与包被有链亲和素的MagneSphere? 顺磁性颗粒(Cat.# Z5481)一起孵育，以捕获生物素标记的融合蛋白。蛋白经过 SDS－PAGE凝胶电泳分离，并使用抗-FLAG抗体对其进行Western Blot 分析。正如预期的那样，经过配基处理的细胞和对照细胞均表达了海肾（Renilla）萤光素酶-HaloTag™-FLAG蛋白（图7A，泳道1和4）。然而只有与配基处理过的细胞胞质共育的磁珠，能够捕获海肾（Renilla）萤光素酶-HaloTag™- FLAG蛋白（图7A，泳道3和6）。重要的是，在磁珠上捕获的融合蛋白仍保留海肾（Renilla）萤光素酶的活性（图7B）。

结论：
　　HaloTag™ 可互换标记技术用于活细胞和体外实验中产生具有宽谱光学特性和功能的标记蛋白。这种新技术可以用来成像活的或固定哺乳动物细胞，允许使用者监测 HaloTag™ 融合蛋白在细胞内部的迁移，观察亚细胞结构或蛋白更新周期。该技术也可以采用 SDS-PAGE 电泳（细胞到凝胶）分析，来检测各种翻译后事件，或是直接从活细胞，或体外转录/翻译反应中，通过固相载体捕获HaloTag™ 融合蛋白和蛋白复合物。因此该系统可以方便地应用于不同的细胞系和生物体，从而提供一种通用的、完整的实验方法，用于蛋白和蛋白功能研究。

技术手册： 详见 Promega 公司 HaloTag™ Interchangeble Labeling Technical 的技术手册#TM260.

图6. 表达HaloTag™ 蛋白的固定细胞被HaloTag™ TMR或HaloTag™ diAcFAM配基所标记而得到的强荧光影像。A，B，E，F为瞬时转染了HaloTag™ pHT2载体的HeLa细胞，C，D，G，H为对照细胞。A到D为标记了5μM HaloTag™ TMR配基，E到H为标记了10μM HaloTag™ diAcFAM配基，操作参照图1的规程。细胞以3.7%的多聚甲醛固定，使用适当的TMR和FAM滤过或透光装置，在Olympus FV500共聚焦显微镜下获得以上影像（图B，D，F，H）。

图7. 包被有链亲和素的磁颗粒对HaloTag™ 融合蛋白的有效捕获。CHO-K1细胞瞬时转染HaloTag™ pHT2载体，该载体编码Renilla荧光素酶-HaloTag™ –FLAG融合蛋白。细胞在无HaloTag™ 生物素配基和有该配基条件下（5μM或25μM，15分钟，37℃）培养。细胞被裂解，生物素标记蛋白被链亲和素包被的磁颗粒（Cat.# Z5481）捕获。图7A：以抗-FLAG抗体M2（Sigma）做Western blot分析。泳道1，细胞裂解液（+配基）；泳道2，未结合的蛋白（+配基）；泳道3，结合的蛋白（+配基）；泳道4，细胞裂解液（-配基）；泳道5，未结合的蛋白（-配基）；泳道6，结合的蛋白（-配基）。图7B：使用Renilla荧光素酶底物（Part#E289B）来检测捕获的荧光素酶的活性。仪器为Orion Microplate 发光检测仪 (Berthold检测系统)。

参考文献
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