图2. 使用psiCHECK^TM -2载体选择p53基因的靶位点。图A. 将HEK293T细胞接种于96孔板，密度为3,000细胞/孔。利用Sgf I 及Not I内切酶位点，将人p53 cDNA克隆到psiCHECKTM-2载体。分别用每孔0.02μg psiCHECK^TM-2载体：p53及每孔0.08μg siLentGene^TM -2 U6发夹盒（兰色柱）或基本型psiCHECK^TM-2载体（红色柱）转化细胞。CodeBreaker^TM siRNA转化试剂（E5052）用于转化DNA盒结构，TransFast^TM转化试剂（E2431）用于转化载体DNA。针对人p53的5个靶位点的shRNA作为对照。使用了针对海肾荧光素酶完全互补的或4个碱基错配的shRNA。将这些数据与用针对非特异性序列shRNA转化细胞的数据进比较。转化后48小时，使用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(Cat.#E1980)测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。数据以针对不同靶位点的shRNA产生的海肾荧光素酶活性（经过校正）抑制百分比表示。数据为12孔的平均值加减标准差。图B. 用HEK293T细胞测定抑制作用并用Western blot方法进行分析。单独用非特异序列处理细胞（泳道1），用克隆了非特异序列（泳道2）或p53靶位点4的psiCHECK^TM-2基本型载体处理细胞（泳道3）。瞬间检测于72小时后进行。

平,提示理想的RNAi效应来自于较大的DNA载体结构。
    为了验证上述方法，需要证明表达针对p53靶位点4的shRNA对内源p53蛋白的抑制作用。图2B给出了用表达针对非特异性序列（泳道2）与针对p53靶位点4（泳道3）的psiCHECK^TM-2基本型载体转化HEK293T细胞的Western blot分析结果。分析结果显示，在shRNA处理的细胞中，p53蛋白含量（用β-actin校正）的降低超过了80%。，确认了使用psiCHECK^TM载体得到的结果。

监测RNAi的动力学
    使用psiCHECK^TM载体中的海肾荧光素酶可以实时监测由RNAi介导的海肾荧光素酶在活细胞中的表达。图3显示用含有人p53 cDNA 的psiCHECK^TM -1载体与表达针对

海肾荧光素酶或非特异性序列或p53的psiCHECK^TM-2基本型载体共转化的细胞中海肾荧光素酶活性的变化。于转化后17小时向培养孔中加入非裂解EnduRen^TM 活细胞底物，监测其后26小时到41小时的相对光强度。我们观察到，在用针对非特异性序列shRNA转化的细胞中，海肾荧光素酶活性显著升高，而用针对海肾荧光素酶或p53靶位点4的shRNA转化的细胞中，海肾荧光素酶的表达只有轻微的升高。在用功能性shRNA转化的细胞中于41小时测到了对肾荧光素酶80%的抑制率。上述结果与图2中用终点分析法得到的抑制结果相一致。实验终了时，加入CellTiter-Glo®荧光细胞存活检测试剂(Cat.#G7570) 以确定细胞的生存状态。当海肾荧光素酶信号用每孔中的活细胞数校正后，抑制水平没有变化，但是，在信号变化方面，孔与孔之间表现出显著的降低（数据未列出）。

图3. 活细胞中海肾荧光素酶活性变化的测定。将HEK293T细胞接种于96孔板，密度为3,000细胞/孔。培养过夜后用转化混合物处理细胞。转化混合物的组成为：35μl 无血清培养基，0.3μl TransFast^TM转化试剂（E2431），每孔0.02μg psiCHECK^TM-1载体：p53及每孔0.08μg psiLentGene^TM -2基本型载体。本实验中psiLentGene^TM -2基本型载体表达针对p53，海肾荧光素酶或非特异序列（阴性对照）的shRNA。培养1小时后，向每孔加入100μl含血清培养基。转化后17小时，加入EnduRen^TM活细胞底物(E6481)，使其终浓度为60μM，并监测海肾荧光素酶活性。

对多个目标筛选多个shRNA
    我们分析了由一组caspase基因RNAi引起的沉默效应以确定本系统在鉴定其它基因的有效RNAi位点方面的可用性。我们使用siLentGene^TM -2 U6发夹克隆系统提供的快速PCR方法，得到了shRNA。用针对caspase不同靶位点的PCR产物与含有caspase基因编码cDNA 的psiCHECK^TM-2载体共转化细胞。转化后48小时测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶的活性。柱状数据列于表4。图A，用克隆了caspase-8