cDNA的psiCHECK^TM-2载体及表达针对caspase-3、caspase-7、caspase-8 及caspase-9的不同靶位点的DNA盒共转化Hela细胞。数据显示，当与psiCHECK^TM-2: caspase-8载体共转化时，只有含有针对caspase-8靶序列的一个shRNA（位点3）表现出对海肾荧光素

图4。 多个候选shRNA的筛选。图A. 将caspase-8 cDNA克隆到psiCHECK^TM-2基本型载体的多克隆区域作为psiCHECK^TM-2：caspase-8载体。设计3个特异性抑制caspase-3，caspase-7，caspase-8和caspase-9的候选shRNA。siLentGene^TM-2盒表达的shRNA通过PCR单独获得。用psiCHECK^TM-2：caspase-8载体与针对不同靶位点的siLentGene^TM -2 DNA盒共转化Hela细胞。转化后48小时，用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(Cat.#E1980)测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。海肾荧光素酶相对光强度单位用表达的萤火虫荧光素酶活性校正。图B. 用克隆了caspase-3，7，8 或caspase-9的psiCHECK^TM -2载体与表达针对相应caspase靶位点shRNA的siLentGene^TM -2盒共转化Hela细胞。转化后48小时，用图A. 所描述的方法测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。数据用抑制百分比表示。非特异shRNA转化细胞中校正后的海肾荧光素酶活性与针对不同caspase和不同靶位点的shRNA转化细胞中校正后的海肾荧光素酶活性的比值即为抑制百分比。

酶活性明显的抑制作用。针对不同caspase（例如：caspase-3，7或9）靶位点的shRNA对海肾荧光素酶活性未表现出明显的抑制作用。

    用含有相应caspase（例如caspase-3）cDNA的psiCHECK^TM-2载体与表达针对相同caspase（本例中为caspase-3）多个靶序列shRNA的DNA共转化的数据示于图4，B。数据以抑制海肾荧光素酶活性的百分比来表示，而海肾荧光素酶活性通过转化了非特异性shRNA的细胞中的海肾荧光素酶活性与转化了不同靶位点的shRNA的细胞中的海肾荧光素酶活性的比值来校正。所有检测的caspase-3靶序列均未显示出对海肾荧光素酶活性的明显抑制作用。由DNA片段表达的，对caspase-3，caspase-8 和caspase-9最有效位点表现出46%-64%的抑制作用，但是基于我们以前有关海肾荧光素酶及p53靶位点分析的数据，如果将DNA片段克隆到合适的载体，抑制水平将会有所升高。

结 论
    为了在鉴定及定量RNAi启动因子（如shRNA或siRNA）方面为研究者提供帮助，Promega公司开发了psiCHECK^TM载体系统。一旦感兴趣的基因被克隆到所选择的psiCHECK^TM载体，就可以利用定量并快速的方法来优化RNA干扰。psiCHECK^TM -1载体与EnduRen^TM活细胞底物一同使用可以连续监测活细胞内显示RNAi的海肾荧光素酶表达的降低。由于包含了萤火虫荧光素酶表达盒，对来自psiCHECK^TM -2载体的海肾荧光素酶表达结果可以进行校正，因此减少了实验及转化中的偏差，得到可信，重复性好的结果。

参考文献
1. Khvorova, A. et al. (2003) Cell 115, 209-16.
2. Ui-Tei, K. et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32, 936-48.
3. Hsieh, A. et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32, 893-901.
4. Kumar, R. et al. (2003) Genome Res. 13, 2333-40.
5. Mousses, S. et al. (2003) Genome Res. 13, 2341-7.

技术手册
● psiCHECK^TM Vectors Technical Bulletin #TB329,Promega corporation.(http://www.promega.com/tbs/tb329/tb329.html)