| psiCHECKTM载体如何发挥作用？
图1是psiCHECKTM载体作用机理的基本示意图。将感兴趣的基因克隆到位于合成的海肾荧光素酶基因及其翻译终止密码子3'端的多克隆区域。克隆后，将载体转入哺乳动物细胞系，海肾荧光素酶基因与靶基因的融合体得以转录。如果转录本是完整无损的，功能性的海肾荧光素酶即可被翻译。表达shRNA的载体或合成的siRNA可以同时共转化或顺序转化，这取决于你的实验设计。如果特异性的shRNA/siRNA有效地启动作用于靶RNA的RNAi过程，融合的海肾荧光素酶靶基因mRNA序列即被降解，导致海肾荧光素酶的活性下降。
图1.psiCHECKTM载体的作用机理。
对psiCHECKTM载体用途的评价
为了评价这一筛选效应siRNA探针方法的有效性，我们使用位于每个载体多克隆区域的Sgf
I 及Not I内切酶位点，将人p53 cDNA克隆到psiCHECKTM-1和psiCHECKTM-2载体上。内切酶位点位于海肾荧
光素酶翻译终止密码子的3'端。我们也同时设计了5个不同的p53基因的shRNA。为确保所构建的含有shRNA的DNA能够针对p53基因的不同靶位点，我们使用了基本型siLentGeneTM
-2 U6发夹克隆系统(C1860)。siLentGeneTM -2 U6发夹克隆系统可以使用一步法PCR
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得到含有U6启动子- shRNA序列（靶序列-环-反互补靶序列）-U6终止序列的DNA盒式结构。 转录的PCR片段可以直接转入哺乳动物细胞，用于有效预筛选shRNA靶序列，避免了费时的克隆步骤。
为了评价上述方法，我们将含有p53 cDNA的psiCHECKTM-2载体与表达p5
shRNA或无关shRNA（图2，点1-5）的线性DNA共转染HEK293T细胞。另外，我们用相对于有海肾荧光素酶完全互补的，或4个错配碱基的shRNA作为阳性对照。萤火虫及海肾荧光素酶信号使用Dual-Luciferase®
报告1000检测系统(E1980)产生。我们通过监测用萤火虫荧光素酶信号校正的海肾荧光素酶活性下降来确定不同的shRNA的效应。为确定从线形DNA表达的shRNA是否表现出同样的抑制作用，我们使用了基本型psiCHECKTM-2载体。我们使用表达针对p53基因不同靶位点的shRNA载体重复实验。图2概括了这些数据。
数据以针对不同靶位点的shRNA产生的海肾荧光素酶活性的（经过校正）抑制百分比表示。与非特异性对照相比，由针对海肾荧光素酶（按照操作手册TB329介绍的PCR方法得到）的线形DNA片段表达的shRNA表现出对校正后的海肾荧光素酶信号有43%的降低，并且通过将错配碱基导入靶序列可以消除这种抑制作用。5种针对p53的shRNA对海肾荧光素酶/
p53均有抑制作用；但是，抑制水平在56%（点2）-74%（点5）之间变动。将线形DNA片段克隆到psiCHECKTM-2基本型载体后，可以观察到相似的抑制作用（兰色柱与红色柱相比）。在两种情况下，点4的p53表现出最高的抑制水平。但是，当用表达shRNA的载体转化细胞时，实际的抑制水平会更高。当psiCHECKTM-2基本型载体表达针对p53靶位点4的shRNA时，可以检测到表达的海肾荧光素酶-
p53蛋白有86%的降低。
从这些数据中可以得出一些结论。首先，盒式系统及载体系统均表现出抑制效果。其次，通过PCR方法得到的DNA分子可以直接转化细胞以筛选合适的靶位点。再次，当将shRNA分子克隆到适合的载体(psiCHECKTM-2基本型载体)时，表现出最高的抑制水
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