Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。传统的分离、复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速及pH的变化可以很容易的调节。大肠杆菌表达的scFv
融合蛋白质包涵体。ScFv 片段在Eocli 中表达量很高，但经常会形成包涵体。因此需要进行复性。
材料与方法
脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸
(arginine)、Triton X-100和DNAse购于Sigma。GSSG，GSH购于Roche。Berol
185 购于Akzo Nobel 表面化学公司，Sweden。所有层析介质均为Amersham Pharmacia
Biotech公司产品。其它试剂均为分析纯。实验用水为Millipore 纯水系统生产。所有层析实验在AKTA
Explorer 层析工作站上进行。用于scFv57P 活性检测的Biacore 2000 为Biacore(Sweden)
公司生产。电泳设备采用Amersham PharmaciaBiotech 公司的PhastSystem
电泳设备。
克隆与表达scFv57P
Fab57P 的scFv 抗体片段是通过VH-linker-VL
的走向构建成pscFvHL57P [2]。载体选择用pscFew，它有一段可以使蛋白质表达到周质的pelB
引导序列；一个15-aa linker,VH-SRGKSSGSGSESKST-VL，来连接抗体可变区的两个domain；C-terminal
的B10tag 用于免疫识别[3] 。在pscFvHL57P 中VH domain 被设计成XhoI-XbaI
位点，PCR扩增目标片段，VL domain 被设计成SacI-SpeI 位点。PCR扩增目标片段。
ScFv57P 抗体片段通过前人的方法表达在E.coli 中[4]。通过Western
blot鉴定（用抗B10的抗体），发现表达的scFv57P形成对还原剂敏感的聚集体。经BIAcore
鉴定细胞周质提取物原液，发现活性抗体片段的产量为5-10 µg/l[5]。
在pBAD/Thio-TOPO 中克隆及过量表达scFv57P
以质粒pscFvHL57P为模版，将编码scFv57P的目的片段基因用PCR扩增。正相引物为(5’-
acactgggatccatggcccaggcccaggtgaaactgctcgag-3’），其中包含了T7
RNA polymerase的增强子和scFv57P 中Vh的起始基因片段(下划线部分)。反相引物为5’-
cacgatgcggccgctcgagtcgactaaacgttcgcgaccgccctgacg
- 3’ 用来保持原始pscFvHL57P 构建的C端的B10 tag (下划线部分）。扩增产物在N端多出4
个氨基酸，在C 端多出8个氨基酸(在B10 tag之后)，这是为了增加了几个不同的单一的酶切位点，简化后继的克隆表达。PCR
过程如下：95℃ (1 min) - 43 ℃ (1 min) - 72 (2 min), 30个循环。然后根据产品手册中的说明将扩增的目标基因直接嵌入pBAD/ThioTOPO
（Invitrogen company) 质粒载体 |
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中，然后转化入TOP10 E.coli 宿主菌细胞内。在最终scFvHL57P 在N 端与thioredoxin
(Trx) 融合在一起(Fig. 1B) 并包括一个源于pscFvHL57P 的B10 tag，V5 tag，GKPIPNPLLGLDST
和在C 端的一个源于pBAD/Thio-TOPO 的6*His 的tag。阳性克隆通过检测过量表达产物的分子量来确定，对应的分子量应与构建的thioredoxin-VH-linker-VL-B10-V5-6His相一致。
图1. A:不同的scFv57P的构建；B:trx-scFvL57P连接到pBAD/Thio-TOPO
vector上的方式。
表达单链抗体融合蛋白的TOP10 E.coli 在含有Ampicillin（100 µg/ml)
的LB 培养基中培养至OD600
= 0.5，然后用0.01% 的L-arabinose 诱导。在37℃下用摇床培养4-5 小时后融合蛋白质包涵体含量达到最大，约为总蛋白质的50%左右。尽管thioredoxin
的可溶性很好，但thioredoxinscFv57P融合蛋白质仍以包涵体形式存在。
传统离心的方法分离包涵体蛋白质
破碎缓冲液组成：20 mmol/l Tris-HCl,
pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAse (10 µg/g
cell) 细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。称取5 g大肠杆菌菌体溶于40 ml 破碎缓冲液中，搅均。用French
press 进行破碎操作，至少进行三次循环。破碎后的匀浆在10,000 rpm下离心30 min 后，弃去上清液。离心后的沉淀物质分别用含0.05%
Chaps, 0.05% Triton X-100及2 mol/l NaCl 的细胞破碎缓冲液进行悬浮、洗涤并离心。洗完后将沉淀用40
ml的破碎液悬浮，并加入urea 至终浓度为8M，再加入DTE至0.2 mM，室温放置5-6小时后用10,000
rpm下离心30 min弃去沉淀。溶解了的包涵体蛋白质溶液用HCl 调pH 到2-3之间，将样品加入Sephadex
G-25 desalting column。在此之前此脱盐柱先用20 mmol/l Tris-HCl，pH2.0，1mmol/lEDTA，8mol./l
脲充分平衡。
用凝胶过滤分离包涵体蛋白质
在前面的细胞破碎液内再加入60 µg/ml的溶菌酶及0.1%的Trition
X-100。3.24 g 的E.coli 用25 ml 的破碎液悬浮。经过French Press破碎后(循环三次)，将破碎液直接加入到1.6*60
cm (120 ml) 的Sepharose HP，这是一种平均粒径为34µm的高度交联的agarose
基质胶(通常
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