随着时间的延长而提高。但是，尽管如此，即使3小时后它的信噪比依然比基于发光法的DPPIV-Glo™ 蛋白酶检测低很多。由于采用了双酶反应偶联的方式，均相的 DPPIV-Glo™ 蛋白酶检测试剂盒的灵敏度在相当长的时间内保持相对一致。DPPIV 及萤光素酶的活性迅速达到稳态，发光信号在20–30 分钟内达到峰值，并可保持数小时，很少衰减。本检测试剂盒的半衰期大大超过4小时 (图4)。 这一特点使得DPPIV 活性检测快速、灵敏、灵活。

用于高通量DPPIV 抑制剂筛选的理想工具
　　本检测方法具有灵敏度高、速度快、检测时间灵活等特性，使得DPPIV-Glo™ 检测成为抑制剂筛选的有用工具。由于化合物库经常存放于DMSO中，我们观察了DMSO 对本检测方法的影响。浓度高达5% 的DMSO对本检测方法未表现出影响。DMSO浓度达到10%时，信号及

  

背景有轻微的下降（图5）。

　　我们使用了DPPIV-Glo™ 检测试剂盒测定已知的DPPIV抑制剂并计算IC50。双蛋白A(Ile-Pro-Ile)是一种DPPIV的竞争性抑制剂（8）。将该抑制剂用DMSO悬浮并用缓冲液系列稀释。DMSO的最大浓度为0.5%。所加入的DPPIV底物的浓度为0.1μM, 这一浓度明显低于它的表观K50。当竞争性抑制剂的浓度远低于Km时，IC50 = Ki (9)。 使用GraphPad Prism® 软件计算IC50为2.7μM（图6）。 这与公布的3.5μM Ki非常相近(8)。

　　为了评价本检测方法的质量，对于不同浓度的DPPIV，我们计算了96孔板中的Z′值(图7)。Z′值大于0.5说明检测质量优良(10)。Z′值随着 DPPIV浓度的下降而下降，但是，即使 DPPIV 浓度低至10pg/ml, Z′值仍为0.59, 说明本检测方法是合适的、可以信赖的。
     

图4. DPPIV-Glo™ 蛋白酶检测试剂盒的信号稳定性。 将重组的DPPIV酶进行滴定定量，然后用DPPIV-Glo™ 检测试剂盒，测定96孔板中重组DPPIV酶的量。 用Dynex MLX® 发光光度计监测4.5小时内的发光。图 A. 在很宽的 DPPIV浓度范围内，本检测方法在数小时内均给出稳定的信号，结果在对数坐标中标出。 图 B.发光的半衰期远远超过4 小时, 1ng/ml DPPIV 浓度的结果在线性坐标中标出。 所有点为4个孔的平均值。

     

图5. DMSO对 DPPIV-Glo™ 检测的影响。 将不同浓度的 DMSO 或缓冲液对照与纯化的 DPPIV 酶 (0.25ng/ml)混合并使用 DPPIV-Glo™ 检测试剂盒在96孔板中进行检测。30分钟后用Dynex MLX® 发光光度计检测发光强度。所有点为4个孔的平均值。

  

图6. IC50 值的确定。使用DPPIV-Glo™ 蛋白酶检测试剂盒确定DPPIV竞争性抑制剂双蛋白A的IC50。能够导致50%的酶活性被抑制的抑制剂浓度为IC50。抑制剂用DMSO悬浮，用10mM Tris-HCl (pH 8.0) + 0.1% Prionex® 系列稀释并于96孔板上与50pg/ml DPPIV混合 。DMSO的最大浓度为 0.5%。试剂加入30分钟后记录发光， 使用 GraphPad Prism® 软件计算IC50为2.7μM。