3. cDNA产量及FOI

样品           cDNA产量(ng)  参入染料(pmol)     FOI

肺总RNA(商用制备)n=7
Cy®3 1,582± 60 155±7 32±1
Cy®5 1,735±98 83±6 16±1
Hela总RNA(SV 总RNA 的提取系统)n=8
Cy®3 1,519±82 156±10 33±1
 Cy®5 1,628±149  106±13 21±1
肺mRNA(商用制备)n=8
Cy®3 527±22 68±5 42±2
Cy®5 515±64 40±7 42±2
293T mRNA(PolyATtrac® mRNA提取系统)n=8
Cy®3 446±22  57±5 42±2
Cy®5 452±18 32±2 23±1

    用商用来源的总RNA及用SV 总RNA 提取系统(产品目录号: Z3100)分离到的总RNA做模板标记cDNA。产量及FOI在样品种类之中及之间是一致的。同样的,以商用来源的 mRNA及用PolyATtrac® mRNA提取系统分离到的mRNA做模板标记cDNA,产量及FOI在样品种类之中及之间是一致的。所有的实验结果均落在表2的期望值之内。利用Proton!TM Plus系统技术手册TM 243所述的SV 总RNA 的提取系统从2x106 Hela 细胞及 2x106 293T细胞中分离总RNA。利用技术手册TB 087及TM021 所述的RNAgents®总RNA 的提取系统(产品目录号: Z5110)并结合PolyATtrac® mRNA提取系统从Hela 细胞及 293T细胞中分离mRNA。以 5μg总RNA或 1.5μg mRNA为模板,利用Proton!TM Plus系统技术手册TM 243所述的ChipShotTM 标记及标记物的纯化系统制备标记的cDNA。 

图2. 预浸泡处理减少Cy®3 的自发荧光,导致低背景并提高分辨率。利用Proton!TM Plus系统技术手册#TM 243所述的Proton!TM 点样方法,将阵列印记于UltraGAPSTM载片上。所有印记均与Coring®合作完成。对处理前(左列),预杂交后(中间列)或双色杂交后(右列)的载片,分别利用Axon GenePix® 4000b微阵列扫描仪并使用相同的设置扫描载片,用 GenePix® 软件对载片进行分析。阵列印记并存放超过2年,在印记区有显著的自发荧光积累(左列)。载片经过相同的预杂交而上端载片再与预浸泡液温育以消除自发荧光的污染(中间列)。预浸泡处理显著地降低了背景并提高了可检测特征的数量。

 

     Proton!TM Plus试剂与UltraGAPSTM载片的结合,在实验中及实验间都可以得到高重复性的数据(图3)。图3所示,图B表示3次独立的标记及杂交实验的%CV,每一次实验包括3-4张载片。每一通道的原始数据利用微阵列的全部信号进行标准化,并且,利用每个微阵列的30000个以上基因计算Cy®3:Cy®5的比值(分析前已减去空白点及阴性对照)。分析结果显示,载片之间的偏差小于10%,为评估微阵列数据的有效性及可解释性提供了较高的可信度。      

图3.使用Proton!TM Plus系统时,实验的重现性。图A. 从4张有代表性的4 人的癌症阵列(由Coring® 公司提供) 中选出的图片。以 5μg总RNA模板,利用Proton!TM Plus系统的ChipShotTM 部分制备标记的cDNA。利用SV 总RNA 提取系统从Hela (Cy®3) 细胞及293T (Cy®5) 细胞中分离总RNA。图B. 重现性通过确定3次独立实验(包括单独的cDNA标记)的3-4张微阵列的4,000个点的偏差系数(%CV=标准偏差/平均值)来评估。每次实验载片之间的 %CV 小于10% ,说明在实验中或实验间都具有很高的重现性。载片的印记按图2所述方法。杂交按Proton!TM Plus系统技术手册TM 243所述的 Proton!TM 通用试剂系统进行。利用Axon GenePix® 4000b微阵列扫描仪扫描载片,用GenePix®软件对载片进行分析。