普洛麦格中文通讯 2002年第五期

原文在Promega Notes 85第15- 18页

摘要：

　我们开发、优化了一种采用T7 RNA 聚合酶和退火的DNA寡聚核苷酸模板，体外合成短干扰RNA（siRNA）或发夹siRNA方法。在不同的哺乳动物系统中进行的RNA干扰研究表明合成的siRNA是有功能的。体外有效、廉价地合成siRNA有助于快速筛选多个靶点，识别具有强烈沉默效应的siRNA。

T7 RiboMax™ Express RNAi Syestem可用于体外快速、有效地合成siRNA或发夹siRNA，在哺乳动物细胞中进行RNA干扰研究。

前言

    RNA干扰是一种双链RNA（dsRNA）通过激活互补的靶mRNA的特异降解来抑制靶蛋白表达的现象（综述见参考文献1及其相关文献）。RNA干扰是研究基因功能的有力工具，研究人员可通过敲除或下调靶蛋白的表达水平研究基因的功能。

    RNAi涉及许多步骤，包括RNaseⅢ家族成员（如：果蝇的Dicer）识别dsRNA，并将其切割为21－23个核苷酸的siRNA (2-4)。siRNA整合成RNAi靶复合物RISC（RNA诱导的沉默复合物），从而破坏了复合物中与siRNA结构同源的mRNA（3，4）。

    在大多数哺乳动物细胞中，引进长链dsRNA（>30bp）可诱导潜在的抗病毒反应，导致mRNA降解，并阻止蛋白合成（5）。然而，化学合成的siRNA在很多哺乳动物细胞中能诱导特异的基因沉默，而不引起非特异的抗病毒反应（2，6）。最有效的siRNA双链长度为21个核苷酸，包括19bp的双链序列，每个3'末端为2个尿嘧啶的突出端（7）。

    研究表明在体外可采用T7 RNA聚合酶成功合成有功能的siRNA和发夹siRNA（8，9）。采用T7RNA聚合酶合成siRNA的唯一要求是靶mRNA中含有GN17C序列，因为T7 RNA聚合酶偏爱核苷酸G作为转录起始位点（10）。

    T7 RiboMax™Express RNAi Syestem可用于体外快速、有效合成siRNA或发夹siRNA，在哺乳动物细胞中进行RNA干扰研究。另外，该系统也可合成较长的dsRNAs，用于许多非哺乳动物细胞的RNAi研究 (11)。和其它标准的体外转录反应相比，该系统对缓冲体系、NTP浓度、T7RNA聚合酶、无机焦磷酸化酶及镁离子水平进行了优化，RNA产率大大增加。

(11)。和其它标准的体外转录反应相比，该系统对缓冲体系、NTP浓度、T7RNA聚合酶、无机焦磷酸化酶及镁离子水平进行了优化，RNA产率大大增加。

用RiboMax™ 系统合成siRNA

图1显示了采用T7 RiboMax™ Express RNAi 系统合成siRNA的流程图。第一步是合成DNA模板，即2条DNA寡聚核苷酸退火形成双链，一般20μl体外转录反应需要加入20 pmol双链寡聚核苷酸。采用T7 RiboMax Express T7缓冲液和酶混合物可在30分钟内有效合成RNA。而后加入DNase消化除去DNA模板，而彼此分离的RNA单链可退火形成siRNA。这种单链小RNA可自身退火形成发夹结构。采用醋酸钠和异丙醇沉淀siRNA，产物溶解后可在聚丙烯酰胺凝胶上检测产物的大小和完整性。用凝胶分析或RiboGreen(r)分析（Molecular Probes）对siRNA进行定量分析。

我们采用T7 RiboMAX™ Express RNAi 系统合成了针对多个靶点的21bp siRNA，包括发夹siRNA。每种siRNA在体外转录和纯化后，在4－20％还原聚丙烯酰胺凝胶上进行检测，并和相同大小的化学合成的siRNA进行对比。如图2所示，体外合成的siRNA和化学合成的siRNA迁移率是一致的，较大的发夹siRNA迁移较缓慢，与预期一致。

体外转录
↓	37℃×30分钟
DNase外理
↓	37℃×30分钟
退火形成siRNA
↓	70℃×10分钟室温放置20分钟
乙醇沉淀
↓	在冰上放置5分钟微型离心机离心10分钟
重悬，定量，分析siRNA

图1.采用T7 RiboMAX™ RNAi表达系统产生和纯化siRNA的操作步骤