单管蛋白系统3设计用于在体外直接从超螺旋或线性DNA模板制备蛋白。该方法根据一个偶联的反应，先用噬菌体RNA聚合酶转录，随后用优化的兔网织细胞裂解物翻译。任何插入到T7或SP6启动子下游的DNA编码序列直接加入反应体系，即可迅速表达为蛋白。转录模板可以是超螺旋或线性DNA或PCR产物。与翻译合成RNA模板的标准方法相比，该系统可避免通常情况下需要4-6小时的多步烦琐操作（包括限制酶消化、线性质粒DNA纯化和RNA纯化）。而且，STP3方法直接从引物扩增产生的PCR产物有效地制备蛋白，配合使用带有翻译增强信号的Novagen
pCIET騎7Blue-2载体能够进一步增强翻译。
在标准STP3反应中，DNA模板（通常是0.5mg质粒或2ml扩增产物）在30℃转录15分钟，加入翻译混合物并继续孵育60分钟。所有成分都是预先混合好的，因此只要加入模板、水和未标记甲硫氨酸或35S-甲硫氨酸（试剂盒中未包括）。
标准试剂盒配有足够进行50个标准50ml反应或100个小量（25ml）反应的试剂。也可选用试用型10标准反应试剂盒。试剂盒包括含有大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因的阳性对照DNA。可通过标准掺入分析、非放射性S.TagTM快速分析或FRETWorksTM
S.Tag分析、S.Tag TM蛋白杂交或用BetaFluorTM b-Gal分析试剂盒直接检测b-半乳糖苷酶活性来检测STP3对照反应的产物。严格的对照试验有助于用单管蛋白系统3获得最高的活性、最低的背景和最一致的结果。
应用
√ 快速评价pET、pBACTM、pTriExTM或其它表达载体结构
√ 基因/蛋白功能分析
√ 蛋白-蛋白、蛋白-核酸和蛋白-配体相互作用
√ 确定开放读码框架
√ 筛选无义或移码突变，蛋白删截试验
√ 与菌落筛选、连接PCR、RT-PCRT和外显子PCR的PCR模板兼容
STP3 PCR模板制备方法
单管蛋白系统3快速蛋白分析的模板制备方法很多：通过使用合适的引物，可直接从细菌菌落、质粒制备物、杆状病毒裂解物或从与不同载体的连接反应通过PCR合成STP3模板。此外，通过在5’引物（如T7/polh引物）中导入T7或SP6启动子、上游间隔子和翻译信号（如果需要），可从非表达载体、无T7或SP6启动子的载体、基因组DNA外显子或细胞mRNA的RT-PCR产物来制备模板。
|
