聂 松 陈 平 梁宋平*
(湖南师范大学生命科学学院，长沙，410081)
摘要 生物分子相互作用分析质谱方法 (BIA/MS)在蛋白质组学研究中是一种非常有应用前景的鉴定蛋白分子相互作用方法。这种方法整合了表面等离子共振技术(SPR)与基质辅助激光解吸时间飞行质谱技术，发展成一种对蛋白相互作用实时分析并直接鉴定的方法。本文利用这种方法对微球蛋白和其抗体这对相互作用蛋白进行分析和鉴定。把微球蛋白抗体偶联到芯片上，让微球蛋白溶液流过芯片表面，然后使用“三明治”结构的微再生方法把结合的微球蛋白从芯片上洗脱下来，再对其进行了酶解，质谱鉴定，在fmol水平得到了明确的结果。
关键词：BIA/MS；SPR；生物芯片；蛋白质组学；
BIA/MS(Biomolecular interaction analysis-mass spectrometry)是一种SPR技术和质谱技术结合的方法，用来鉴定生物组织中与偶联在芯片上的连接子结合的分子。BIA/MS在蛋白组学中主要有以下两方面的作用：(1)非常灵敏地检测和定量两个生物分子间的结合。(2)纯化小量的样品做进一步的分析。这个方法相对其它以亲和原理为基础的方法有明显的优点，特别是样品量受到限制时这种优势更明显[2，3]。
我们把MALDI-TOF质谱技术和SPR-BIA分析技术相结合发展一种新的BIA/MS技术，以便对与偶联在芯片上的连结子相互作用的生物分子进行鉴定。在实验中，首先把微球蛋白抗体偶联到芯片上，用微球蛋白溶液流过芯片，然后把结合的微球蛋白洗脱下来对其进行鉴定，进而对稀释100倍的人血清样品进行分析，均得到了明确的结果。该方法简单，经济，灵敏，快速，在蛋白质组学研究中是一种非常有应用前景的方法[4-6]。
1． 材料和方法(Materials and Method)
1.1 仪器和试剂
胰蛋白酶(Trypsin)，微球蛋白(b2-Microglobulin，human)，鼠抗人的微球蛋白抗体(Monoclonal mouse-anti-human b-microglobulin)。碳18的ZipTipTM；MALDI-TOF-MS为VOYAGER-DE STR系统。Biacore X型(Biacore AB)生物分子相互作用仪和CM5研究级芯片。
1.2 方 法
1.2.1生物分子相互作用分析
采用CM5芯片，鼠抗人的微球蛋白抗体通过氨基以共价键的形式把抗体偶联到芯片上FC1通道上，另一个通道FC2设为空白对照。
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整个实验使用HBS-EP buffer作为缓冲工作液，设流速为5ul/min，温度为25℃。
微球蛋白用HBS-EP buffer 稀释成一系列溶度，每次进样30ul让其相互作用，进样完后60S左右计算其结合的RU值，然后用10mM Glycine-HCl (PH=2.5)洗脱结合的微球蛋白。
1.2.2 参数的计算
求动力学参数(Ka，Kd)采用BIAevaluation(Version3.1)软件，使用1：1(Langmuir)binding模型。
1.2.3 质谱分析
Voyager DE-STR飞行时间质谱仪。
1.2.4 数据库查询
查询的软件为MS-Fit(www.prospector.ucsf.edu/ucsfhtm3.2)，查询数据库为genpept数据库，肽片段的允许偏差为50ppm，允许漏掉一个酶解位点。
2. 结果和分析(Results and Analysis)
2.1 蛋白间相互作用的动力学检测
BIA/MS方法不但可以测定蛋白间是否有相互作用，而且可以定量两者间相互作用的强弱，这是这种方法的优点之一[1]。
β 2-Microglobulin与其抗体相互作用的结合与解离的动力学被实时分析并得到其相互作用曲线(图1)。最后通过BIAevaluation(Version3.1)软件求得两者的Ka=2.76e5，Kd=1.21e-3。从这些数据可以得知这两个蛋白的结合得非常强。
2.1 连接子的偶联
BIA/MS方法的灵敏度主要处决于偶联到芯片上的连接子能结合的分析物的量。为了提高BIA/MS方法的灵敏度，首先，应尽可能地偶联更多的 连接子。微球蛋白抗体的偶联如图2，17000RU(resonance units)被偶联到CM5芯片表面，相当于110fmol的蛋白(1000RU=1ng protein，MW~150000)。这意味着能够结合足够多的蛋白量供进一步的分析。
2.2 结合蛋白的再生及其鉴定
采用Sonksen et al 设计的方法[5]，把微量再生液PH=2.5的Glycine-HCl(约4-6ul)夹在两段气泡间做成“三明治”的结构，这样可以避免再生液被缓冲液稀释而达到对样品浓缩的目的。图3是用这种微再生的方法对微球蛋白样品进行再生的实时分析图。
再生下来的蛋白需要对其进行分子量的鉴定。实验中，一次的相互作用能结合蛋白750RU，相当于60fmol的蛋白被结合。然后以上述的再生方法用5ul 甘氨酸-盐酸缓冲(PH=2.5)
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