双向凝胶电泳中采用中等pH范围IPG胶条,
扩展了图谱,尤其在极端碱性区域
Ray Ismail*, Jan Goscinski*, Siham Cetinkaya, Kjell Larsson, Helena Nordvarg, Ingmar Olsson, Bengt Bjellqvist
GE Healthcare, Amersham Biosciences AB, SE-751 84 Sweden. |
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引言
双向电泳技术是一种分辨率最高的蛋白分离技术。在一个实验中能分离几千个蛋白。然而要想找到低丰度蛋白或偏酸性/偏碱性蛋白时，一个宽范围固相pH梯度（immobilized pH gradient,IpG）胶条是不够的。需要采用更窄的pH梯度胶条，以提高分辨率和上样量。
为证明采用分开的扩展的pH范围胶条的优势，采用四个重叠的中等pH范围的IPG胶条，范围从pH3到pH11，用鼠肝样品进行微制务电泳。得到的双向电泳谱与宽范围的pH3-11 NL IPG胶条的相同区域比较蛋白点数。软件分析表明扩展的中等pH范围胶条的蛋白点数显著提高。
此外，碱性的pH7-11 NL IPG胶条得到很多在pH7-11 NL IPG胶条中没有显示的碱性蛋白。有的碱性蛋白用MALDI-TOF质谱分析鉴定。pH7-11 NL IPG胶条已经过化学修饰以提高蛋白上样量，并在保证重复性的前提下延长聚焦时间。 |
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结论
● 采用重叠的中等pH范围胶条，扩展了pH范围，双向电泳图谱的分辨率显著提高
● 采用中等pH范围的IPG胶条，检测到的蛋白点数增加50-200%
● pH3-11 NL IPG胶条，给出宽范围的总览-中等pH范围胶条是微制备试验的理想选择
● pH7-11 NL IPG胶条的碱性端电泳稳定性提高，可鉴定碱性蛋白 |
图像分析
用ImageMasterTM 2D Platinum双向电泳分析软件分析图像，彩色框内的蛋白点进行计数后表明中等pH范围IP胶条的分辨率明显提高。检测到的蛋白点数在表1中显示。
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结果：
扩展和重叠
来自宽范围pH 3-11NL IPG胶条和4个重叠的中等pH范围IPG胶条的双向电泳凝胶谱图。彩色框对应相同的pH间隔，在中等pH范围IP胶条进行扩展。圈出的蛋白点是胶条间重叠的部分。 |
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图1。pH 3-11NL IPG胶条，采用阳极端杯上样200µg，聚焦45kvh。 |
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分离碱性蛋白
pH 7-11NL IPG胶条稳定性提高（图7中显示pH梯度）。在碱性端分离玻一些在pH 3-11NL IPG胶条中（图6）丢失的蛋白。部分蛋白已用MALDI-TOF（表2）质谱分析鉴定。进一步分析鉴定该样品中更多的碱性蛋白的工作还在继续。然而，鉴定等电点接近11的蛋白，不仅与样品有关，也和样品制务有关。 |
图2.pH 3-5.6NL IPG胶条，采用泡涨上样500µg，聚焦65kvh。
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图3.pH6.2-7.5NL IPG胶条，用纸桥法上样500µg，聚焦130kvh。
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图6.蛋白上样200UG的pH3-11NL IPG 胶条的碱性端.蓝色虚线放在图5和图6的相同的pH位置。 |
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图7. pH7-11NL IPG胶条的计算的pH梯度曲线。 |
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表2.pH7-11NL IPG胶条中已被鉴定的蛋白蛋白点号在胶中要注意出（图5） |
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材料和方法
样品制备
鼠肝组织在冰上超声，用含有20%TCA和0.2%DTT的丙酮溶液于-20℃沉演蛋白，然后在40000*g离心60分钟。沉淀重溶于含有0.2%
DTT的冰浴丙酮溶液中.离心后,沉演干后,溶解于
裂解缓冲液中(2M)硫脲,7M尿素,4%(W/V)CHAPS,1%(W/V)DTT,2%(V/V)
Pharmalyte 3-10mM蛋Quant kit)进行蛋白定量，
蛋白浓度为13mg/ml。
等电聚焦
所有的胶条用DeStreak™ 去除点拖尾泡涨液(DeStreak™ Rehydration Solution)进行泡涨。pH3-11NL IPG胶条上样200μg和500μg。pH3-5.6,5.3-6.5, 6.2-7.5和7-11NL IPG胶条
(Amersham Biosciences)上样500μg和800μg。 |
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所有胶条用Ettan™ Manifold多功能件盒根据说明书在 Ettan IPGphor™ 一向等电聚焦电泳系统上运行(2)。
SDS-聚丙烯酰胺电泳
二向电泳前，两步平衡IPG胶条，每步15分钟，分别用DTT和碘乙酰胺，再在12.5% Laemmli 胶上进行二向电泳（3）。电泳后，蛋白用标准的胶体考马斯亮蓝方法染色，再用ImageScanner™ II扫描仪（安玛西亚公司）进行扫描。
图像分析和斑点处理
凝胶图像用ImageMaster 2D Platinum 5.0 双向电泳分析软伯进行分析。选取蛋白点用Ettan Spot Picker全自动斑点切取系统进行挖胶，再用Ettan Digester 全自动酶切系统进行胶内胰蛋白酶酶切，然后用Ettan Spotter全自动点靶系统将样品点在 MALDI-ToF质谱靶上。用Ettan MALDI-ToF Pro质谱进行蛋白鉴定。 |
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参考文献:
1. A. Gorg, O. Drews and W. Weiss: Separa tion of proteins using two dimensional gel electrophoresis. In: Purifying Proteins for Proteomics: A laboratory Manual. (Ed R. E. Simpson),Cold Spring Harbour Laboratory Press,2004 (p. 391-430).
2. 2-D Electrophoresis Principles and Meth ods Ed. AB (Amersham Biosciences)
3. Laemmli, U.K. Nature 227 (p. 680-685), 1970.
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