介绍
细菌硝基还原酶（NTR）报告基因系统是为多因子单细胞荧光检测细胞内信号传导和基因表达水平而设计的。系统基于NTR和一个细胞可容性荧光染料。NTR是由E.coli B 提取而来的FMN 依赖性酶。由二个48KDa亚基和二个FMN分子组成。其在一系列哺乳动物细胞内表达均未见有毒性的报道。CytoCy5S 是可穿膜Cy5Q 分子类似物，并可作为酶的底物使NTR作为一个报告基因在活哺乳动细胞中表达。该系统采用“红移”荧光，使得在同一细胞中使用其它染料（如EGFP）成为可能。
实验方法
NTR方法分别在活细胞中进行实验，稳定细胞实验中NTR在GEH控制下进入到U-2 OS细胞CHOM1细胞。固定细胞方法采用加入5%Formalin在高温下作用15分钟。图像分析由GEHC 的IN Cell Analyzer1000及相应软年完成。
结果
图1报告基因结构
NTR表达为4-重复反应单元调控，该结构引入到下列细胞株中：
a）经G418筛选的CHOM1 b）经G418筛选的U-2OS
图2中显示的是不同刺激剂浓度下（刺激剂度为NM）由IN Cell Ana-lyzer1000核用Hoechst染色（蓝）和CytoCy5S 信号（红）所获取的图像
图2 加入阿托品实验的图像。图中数字为板孔阿防托品浓度，稳定细胞株数据—GEH报告基因
图3 刺激剂诱导NTR表达。含有GEH-NTR报告基因的细胞株U2OS GEH-NTR用刺激剂诱导4小时后加入CytoCy5S在37 ℃保温3小时
非稳定细胞数据一腺酶毒NTR报告基因方法
图4a活细胞方法 图4b 固定细胞方法 |
|
图4 将GEH-NTR报告基因方法转入到U-2OS细胞中，加入的腺病毒浓度为15mol，每个384孔板数孔中加入4 ×103转化细胞。
使用腺病毒报告基因方法叉无需二个稳定细胞株，阻碍物的过量表达和报告基因均处于同一细胞中，这一方法可使客户将报告基因系统引入到各种适合的细胞中使目标报告产物过量表达。
组合数据
5a )GEP信号 5b)GEP和NTR合成信号
图5NTR报告基因方法和G2M细胞周期标志物方法。
Hoechst核染色（兰色）
图5b G2M和GEH信号分析，GEH控制的NTR引入到G2M细胞周期标志物方法中，加入腺病毒15mol、细胞保存于血清中24小时，刺激剂加入后保温6小时，然后加入终浓度1mm的CytoCy5S，再保温1小时，GFP信号出现在S晚期，从G2到M一直在增加，在进入G1早期消失。从这一组合图像分板中可看到没有明显的细胞周期依赖的GEH反应，然而来的NTR方法的红信息与GFP绿信号间的相关性已得到确证。 |