DPPIV-Glo™检测方法显示出了比基于荧光的DPPIV 检测方法更高的灵敏度。研究人员使用较少量的酶依然可以得到满意的Z′值。

DPPIV-Glo? 蛋白酶检测原理
　　 DPPIV-Glo™ 检测是一种测定 DPPIV 活性的均相生物发光检测方法。本检测系统中含有生物发光前体物质，Gly-Pro-氨基萤光素，作为DPPIV底物。该物质被加入到经过优化的、用于DPPIV及萤光素酶活性检测的缓冲液系统中。在这种均相的、双酶参与的反应中，只需要加入单一一种DPPIV-Glo™试剂就可以使 DPPIV 切割底物，同时激活萤光素酶反应，产生“辉光”型发光信号(图 1)。 DPPIV-Glo™ 试剂依赖于专利的热稳定萤光素酶(Ultra-Glo™ 重组萤光素酶)的独有特点，可以在较宽范围的检测条件下发出稳定的“辉光”型发光信号。

　　DPPIV-Glo™ 蛋白酶检测试剂盒的"加样-混合-检测"方式是为使用多孔板设计的，这也是它成为高通量筛选(HTS)的理想选择。这种双酶反应系统中， DPPIV 切割底物与萤光素酶消耗释放的氨基萤光素同时进行，导致

图1. 发光前体底物含有可以被 DPPIV 识别的 Gly-Pro 序列。DPPIV 切割后，萤光素酶的底物氨基萤光素被释放。引起萤光素酶反应并产生光信号。

发光信号与存在的DPPIV 活性成正比。本检测方法中，DPPIV 的浓度具有很宽的动态范围，从而大大地提高了灵敏度 (图2)。

比荧光检测更灵敏
　　我们比较了DPPIV-Glo™ 蛋白酶检测方法与荧光 DPPIV 检测方法，后者实验中相应的底物为Gly-Pro-

图2.使用 DPPIV-Glo™ 检测系统在96孔板中测定 DPPIV 酶量。 用缓冲液(10mM Tris-HCl (pH 8.0) + 0.1% Prionex® )系列稀释重组的人DPPIV。加入DPPIV-Glo™ 试剂 30 分钟后，用Dynex MLX® 发光光度计记录相对发光单位(RLU)。本检测方法至少在DPPIV的3个对数浓度内呈线性(r2 = 0.9991,斜率= 1.0025)。每个点代表4个孔的平均值。每个孔的数据减去无 DPPIV 对照孔的值(平均背景 RLU = 11.4)。将数据转换成对数图后计算r2 值及斜率。

图3. DPPIV-Glo™ Protease 检测方法与荧光检测方法的灵敏度比较。 将重组的DPPIV酶进行滴定定量，然后用DPPIV-Glo™ 检测试剂盒或Gly-Pro-AMC 荧光底物在96孔板中测定重组的 DPPIV 酶量。用 Dynex MLX® 发光光度计及 Labsystems Fluoroscan Ascent荧光分光光度计分别记录不同时间的发光信号和荧光信号。将结果转换成信噪比。最低检测限定义为当信噪比>3时所需要的DPPIV 的量（虚线）。经证明30分钟内，发光方法的最低检测限<0.3pg/ml，而3小时后，荧光方法检测的极限约为~6pg/ml 。

AMC。DPPIV-Glo™ 检测方法在所有时间点都比荧光检测方法灵敏(图3)。用信噪比[(信号平均值–背景平均值)/背景的标准差] 来考查这两种检测方法的灵敏度。DPPIV-Glo™ 蛋白酶检测方法的信噪比要好10倍, 并且检测极限比荧光检测低10倍 (图3)。

由于释放的游离AMC积累，荧光检测方法的灵敏度