简 介
　　 当前涌现出了很多准确、灵敏并可重复定量DNA样品的PCR技术，这些技术使聚合酶链反应（PCR）更具威力。这些实时或定量PCR（qPCR）技术检测的是每一循环中处于指数增长期的PCR产物。在此我们介绍一种新的实时定量PCR技术，该技术灵敏、特异，并且只需要两种引物即可进行。

引物设计
　　Plexor™技术利用两种经过修饰的核苷酸之间的高度特异的相互作用来实现实时定量PCR检测（1-3）。这两种新的碱基分别是异鸟嘌呤（iso-dG）和5’甲基异胞嘧啶（iso-dC）。当掺入到双链DNA时，形成独特的碱基配对，而且只能二者之间相互配对（图1）。在Plexor™反应中，使用iso-dC合成第一条引物，并用荧光标记5’末端。第二条引物不标记。将iso-dGTP修饰，使其含有做为淬灭剂的dabcyl，再把这种特殊的碱基加入到反应混合物中。在扩增过程中只有dabcyl-iso-dGTP能够被掺入到与iso-dC互补的位置。当掺入的dabcyl-iso-dGTP靠近第一条引物上的荧光标记时，荧光信号即被有效地淬灭（图2）。

　　Plexor™的突出特点是引物设计非常简单。用于Plexor™ 系统的引物设计程序将在网上公布，可以用于单一或多重qPCR反应的引物设计。针对不同反应类别（单一PCR、多重PCR、定量RT-PCR（qRT-PCR））和不同的实时定量热循环仪，Plexor™引物设计软件还可以用

于选择合适的荧光标记物。已经有一些引物供应商获得许可，能够提供带有iso-dC碱基的引物。为方便用户，Plexor™ 引物设计软件中将包括这些供应商的信息。

定量扩增
　　 在这种创新的定量反应中，扩增产物的积累导致荧光信号衰减，衰减程度与反应中原有的DNA模板量成反比（图3）。实时定量PCR仪是将荧光检测模块与热循环模块结合在一起的仪器，可以在每一个循环内检测信号[以相对荧光单位（RFU）表示]的变化。Plexor™反应的扩增结果表现为典型的三相曲线（图3）。在扩增过程的指数期得到的结果可以对起始起始组分给出最佳的估计。在指数期的早期设定扩增临界值。当扩增曲线穿越此临界值时的循环数被定义为样品的临界循环数（Ct）。可以使用已知量的DNA或RNA做系列稀释，把由此得到的一些列Ct值做为该样品的标准曲线。

　　在Plexor™反应中，dabcyl对荧光标记的淬灭是一个可逆的过程。当产物处在双链状态时，dabcyl与荧光标记物紧密相邻，荧光即被淬灭。当双链产物变性时，荧光标记物与淬灭剂分离，导致荧光信号增强。热融解曲线（Tm）可被用于确定扩增产物的融解温度（图4）。将反应体系从较低温度（约60oC）逐渐升温，达到变性水平（约95oC），可得到Tm图。产物的长度及序列可以影响Tm值，通过融解曲线能够了解扩增反应的均一程度。这一点对于评价反应的特异性非常有用，因为不同Tm值的扩增产物可以使融解曲线中出现多个峰或使峰变宽，因此可以轻易辨别非特异产物。融解曲线能够分辨特异与非特异扩增产物的特性可以确认是否仅有一种产物生成。