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尽管DNA序列经过了重大改变，但新设计的pGL4载体的复制条件在E.coli中的筛选及培养都与pGL3相似。
改善萤光素酶的表达
pGL4载体也具有一个改良的萤火虫萤光素酶基因，luc2。与其前身相比（pGL3载体中的luc+）, luc2进行了密码子的优化并具有更少的隐性调控序列（图3）。通过改变在哺乳动物细胞中最常用的密码子，同时去除大多数转录因子的共有结合位点，luc+萤光素酶基因被重新设计合成。另外，在luc2基因中，预计的启动子单元的数量也被减为一个。
在图4中显示的转染实验中，合成的萤火虫萤光素酶基因luc2，显示出其相对于luc+的表达量的增加。为了确认合成的结构仅影响表达，luc+和luc2基因均分别克隆入pGL3对照载体。载体与对照共转染24小时后，以对照为基础，测定相对萤光单位。比较luc+和luc2基因，证实检测的4个哺乳动物细胞系中，luc2的表达量有4.1到11.8倍的增加。
改善的信噪比
修饰了的pGL4载体骨架结合合成的报告基因后，与对应的pGL3和phRL载体相比，信噪比有很好的改善。表2给出了这些载体与它们相应的无启动子载体的对比，
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以及信噪比增加的百分数。在表格的下面，显示pGL4.13[luc2/SV40]载体的信噪比增加373％，信噪比增加最多的是pGL4.75[hRluc/CMW]载体，达6388%。
| 表2 pGL4、pGL3、phRL载体的背景比较。 |
| 载体 |
信噪比 |
增长率 |
| GL4.13[luc2/SV40] vs. pGL4.10[luc2] |
3,162±337 |
373 |
| pGL4.13[luc2/SV40] vs. pGL4.10[luc2] |
668±57 |
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| pGL4.73[hRluc/SV40] vs. pGL4.70[hRluc] |
628±78 |
3,205 |
| hRluc/SV40 vs. phRL-null |
19±1.7 |
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| pGL4.74[hRluc/TK] vs. pGL4.70[hRluc] |
79±8 |
3,335 |
| phRL-TK vs. phRL-null |
2.3±0.9 |
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| pGL4.75[hRluc/CMV] vs. pGL4.70[hRluc] |
1,103±115 |
6,388 |
| phRL-CMV vs. phRL-null |
17±1.5 |
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将含有萤光素酶的载体转染入CHO细胞，24小时后裂解细胞。采用双萤光素酶报告基因系统（Dual-Luciferase® Assay System,Cat.# E1910）测定发光信号，将转染效率对相对发光单位进行归一化。信噪比是用转染含有启动自载体的归一化信号除以转染无启动子载体的归一化信号。实验分别采用了 CHO,HeLa,NIH/3T3和HEK 293细胞，得到了相似结果。
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