图3. Rapid ResponseTM 报告体达到最大诱导所需的时间。将含有多个CREs(cAMP应答元件)的DNA片段克隆到Rapid ResponseTM载体及含有hluc+或hRluc报告基因的pGL3-基本型载体(Cat.#E1751)中。用含有CRE的载体瞬时转化HEK293 细胞。24小时后,加入100μM RO (RO-20-1724) 及1μM异丙肾上腺素(ISO)诱导报告基因表达。单独加入RO的作为非诱导对照。按以下方法收集细胞,裂解并检测:图 A. 使用海肾荧光素酶检测系统(E2810)检测含有以海肾荧光素酶为基础的报告体细胞中的荧光素酶活性。图 B. 使用海肾荧光素酶检测系统(Cat.#E1500)检测含有以萤火虫荧光素酶为基础的报告体细胞中的荧光素酶活性,并使用Correlate-EIA Directed Cyclic AMP Assay(Assay Designs, Inc.) 检测cAMP。在所有情况下,用诱导孔中的相对光强度除以非诱导孔中的相对光强度计算诱导效果。

 

    去稳定萤火虫荧光素酶报告体的最大诱导所需时间也同样缩短。对照萤火虫荧光素酶(hluc+)于6小时达到最大诱导,而去稳定报告体hlucP+与hlucCP+的最大诱导分别发生在1.5及3.0小时(图3,B)。

    除了可以缩短达到最大诱导所需时间外,去稳定报告体还可以提高应答的放大倍数。以海肾荧光素酶为基础的ResponseTM载体(图3,A)可提高67%的放大倍数。以萤火虫荧光素酶为基础的ResponseTM载体hlucP+及hlucCP+,放大倍数提高了102%(图3,B)。

    由于Rapid ResponseTM 报告载体是去稳定的,所以在报告检测中光强度有所降低(图4)。这种降低因所使用的细胞株及去稳定报告体的不同而变化,也因所使用的是稳定转化或瞬间转化的细胞而不同。对于稳定表达的细胞而言,挑选一些最亮的细胞株(例如那些具有每个细胞最大相对光强度的细胞株)表达Rapid ResponseTM 报告体(数据未显示)。对于其它的去稳定报告体,也观察到了相同的结果(6,7)。光强度的降低是否显著,需要在灵敏度测试中进行评估。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶

 

生物评估。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶生物发光检测产生的背景信号非常低,因此Rapid ResponseTM 报告体的灵敏度通常足够用于大多数实验条件。

药理学等效性
    为了考察Rapid ResponseTM 报告载体是否同它们的非去稳定等效物一样,在生理条件下,也能表现出相同的反应,我们用含有CRE、neo、和或者hluc+或者hlucP+的载体转化HEK293T细胞。经过新霉素筛选后,挑选出稳定表达荧光素酶的克隆。用浓度依次升高的 ISO加入细胞培养体系,并于ISO加入后的2、4、6小时检测荧光素酶活性(图5)。最早(2小时)的hlucP+ 及hlucCP+数据与hluc+6小时的数值一致。相同的ISO剂量-反应曲线证明了对细胞的相同药理学反应。

    因此,通过降低荧光素酶报告体的稳定性,我们缩短了达到最大诱导所需时间,提高了鉴别阳性与阴性结果的能力,减低了次级效应的风险。但是,在本实验中,转录速率与细胞的生理状态之间的关系保持不变。