(处理细胞信号的平均值)-(无细胞对照)
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(未处理细胞信号的平均值)-(无细胞对照) |
利用以上定义得到的Caspase-GloTM检测及Apo-One®检测的Jurkat细胞数据的信号/背景比值分别为9.3和9.5。示于图2。尽管绝对值不同,减去背景后,信号/背景比值相同。这表明所有的方法都表现出相同的Caspase诱导率。与生物发光检测不同,随着时间的延长,荧光检测的绝对值会升高。
信号/背景比值主要提供实验系统中有关Caspase活性诱导率的信息。不同方法测定的处理细胞与未处理细胞(减去无细胞对照)的信号/背景比值应当相同,因为Caspase活性诱导率取决于生物系统而与检测所用的化学试剂无关。信号/背景比值在评价细胞事件或监测药品对Caspase活性的影响方面非常有用。信号/背景比值不提供有关检测灵敏度方面的信息,也不提供有关检测偏差的任何信息。如需比较实验方法间的灵敏度,信号/噪音比值则更为有用。信号/噪音比值定义如下:
信号/噪音比值用于解释检测背景的变化。通过除以背景标准差,信号/噪音比值还可以对使用不同相对单位的不同仪器测定的数据进行校正。根据在细胞系统中背景的
图2. 生物发光及荧光Caspase 3/7检测具有相同的信号-背景比值。将“无细胞”背景从表1中的处理及未处理细胞结果中减去。
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不同定义,可以用3种方法计算信号/噪音比值。3种计算方法均可提供系统的有关信息。表2列出了这些定义所能代表的含义。
在表2的例2和例3中分别将处理的或未处理的细胞的信号/噪音比值与“无细胞”背景进行比较。这些方法可以测定所有细胞的Caspase特异活性相对于非特异活性的比值,因此提供了灵敏度的测定方法。在1小时,生物发光检测具有较高的信号/噪音比值。随着时间的延长,荧光检测的信号/噪音比值将升高。Caspase检测的极限可以定义为信号/噪音比值为3(例如:给出的Caspase活性值应至少大于背景3个标准差以上)。在表2的所有例子中,信号/噪音比值揭示,10,000个未处理细胞中的Caspase-3/7活性均在所有检测限以上(Caspase-GloTM检测=185,Apo-One®检测=4)。
使用Caspase-GloTM检测在细胞系统中如何提高信号/背景或信号/噪音比值?
有数个因素可以影响上面的比值,但是请注意,上面的比值往往是由生物系统决定的。Caspase的激活程度决定了结果,而检测中所用的化学试剂不会改变结果。有三个因素会对上面的比值产生负面影响:
1) 处理细胞中的生物发光信号饱和。如果信号达到了荧光发光计的测量极限,信号/背景及信号/噪音比值将出现降低的假象。
2) 如果细胞不健康,未处理细胞中的信号将升高,并且信号/背景及信号/噪音比值将出现降低的假象。不健康的细胞培养可以更快地诱导潜在的细胞凋亡,所以不健康的细胞培养的影响可以有较大的改变。一般而言,在处理过程中优化细胞培养的健康状态可以得到最一致的结果。
3) 重复对信号/噪音比值有显著的影响,所以确保进行了足够的重复测量以准确地确定变量。
可以改变实验条件来提高信号/背景及信号/噪音比值这就引申出一个相关问题。
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