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Pall
离心超滤浓缩装置 Pall
Life Sciences（颇尔生命科学公司）用于超过滤和微过滤的离心设备简化了许多通用的核酸和蛋白质处理程序。我们的Nanosep®
、MicrosepTM
、Macrosep®和JμmbosepTM
设备可以使用于广泛的分子重量截止和许多尺寸的孔，每种都标记有易于分辨的不同彩色条码。这些设备可以在几分钟内对50μl
到60ml的样本进行有效浓缩和脱盐。超过滤可以减少处理的样本量，这将会损坏样本。因此，可以将浓缩样本直接混合到发现过程中关键阶段的下游应用中。
Pall
Nanosep 典型应用举例
1.DNA纯化/限制酶切缓冲液交换
2.从琼脂糖凝液里纯化DNA片断
3.纯化、回收PCR产物
4.提高从稀溶液里回收蛋白质的产率
特殊特征：
快速处理
仅仅需要5-10分钟的时间就可以取得90%的回收。
MWCO’s
广泛的多样性
只要您确定了正确的MWCO或者孔的尺寸，我们的设备就会被打上彩色条码以便于视觉分辨。
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低的蛋白结合
设备由低结合的聚丙烯构成。
设备 |
样本量 |
Nanosep 设备 |
<0.5ml |
Microsep 设备 |
0.5-3.5ml |
Macrosep 设备 |
3-15ml |
Jμmboset 设备 |
15-60ml |
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用带有Omego PES膜的Nanosep设备和常用的竞争者的膜设备来过滤和回收放射标记的BSA。
图中包括两个对立的实验，对两个设备进行三重分析。蛋白质的界定图（绿色的条柱）表明，由于来自于浸入在闪烁粒子混合物中的完整设备干扰，其值要比实际的值低。
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应用：
● 多聚酶链反应（PCR）的净化
● 脱盐
● 缓冲液交换
● 序列测定的净化
● 样本分段
● 样本纯化
● 末端染色剂的净化
● 去除游离的核苷酸
● DNA浓缩
● 蛋白质浓缩
● 去除标记
● 从凝胶中移去蛋白质
● NMR的制备
参考资料：也可以在网址www.pall.com/lab
上获取● 产品数据，用于超过滤和微量过滤的离心设备，PN 32984● 产品数据，细胞搅拌系统和超过滤膜盘过滤器，PN
32985● 产品数据，实验室切线流量过滤设备和系统，PN 32986● 协议（原始记录），Nanosep离心设备，PN
329890● 技术报告，DNA片段的纯化和处理，PN 32981● 技术报告，Nanoset 离心过滤设备和PCR：前和后的使用，PN
32980● 技术报告，用超过滤设备进行单管DNA纯化和克隆，PN 33205● 技术报告，用Nanosep离心单元从聚丙烯酰胺凝胶中快速有效地洗脱蛋白质，
PN 33216 |
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Pall Nanosep 典型应用举例
DNA纯化/限制酶切缓冲溶液交换
说明
为了有效地酶解和修饰，DNA应该不含有一些污染物，比如：酚，氯仿，乙醇，EDTA，去污剂，药品（像DNA研究中经常用的放射菌素和偏端霉素），或者过量的盐。所有这些物质都可以影响限制性内切酶的活性，导致部分酶切，或者特异性改变（星号活性）。
常常推荐使用的方案是透析和乙醇沉淀，然后在限制酶切DNA片段之前洗涤，干燥步骤。经常，用两种或者两种以上的酶酶切DNA底物时，需要用不同的酶切缓冲液，满足不同酶对反应缓冲液的要求（图六）。不连续的恒容过滤（一系列的浓缩和溶解步骤）能够用来简单有效地从DNA样品中去除小分子污染物和盐。这个流程是关于系列限制酶切的，这个基本的去盐/缓冲液交换流程可以改动以适合不同的应用。
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图六 DNA的去盐与酶活性 |
| NruI内切酶为了达到最高的活性需要一种独特的反应buffer。M道表示Marker（用EcoR1和HindIII酶切
λ-DNA）, 1道（负对照）：λ-DNA用NruI酶在NEBuffer1里酶切。2道（正对照）λ-DNA用NruI在NruI
反应buffer里温浴。3道λ-DNA与NruI 在 NEBuffer里温浴，4道：3道里相同的样品，交换反应Buffer，然后用NruI酶切。用100K的Nanosep膜，保证去盐以后，NruI
的活性。 |
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流程详细步骤
1、选择合适MWCO值的Nanosep离心管（表三）。注意：增加溶液里的溶质会减少DNA的通过，需要更大MWCO值的离心管
2、用单浓度的（1X）第二个酶切buffer稀释酶切好的DNA样品至500uL。
3、在5000g下离心，5分钟（100K膜）到30分钟（3K膜）。
4、可选择：进行不连续的恒容过滤时：加足够量的缓冲液是截留物的体积到达500uL，然后再离心。通常两次稀释和浓缩会除去99％以上的盐和90％以上的小分子污染物。如果要求更高的纯度，第三次重复稀释和浓缩步骤。多次的恒容过滤会降低总体产率；但是，同样要考虑质量，而不仅仅是产率。
5、在1X的限制酶切缓冲溶液中重悬，加入第二种酶，而后根据厂商的说明进行酶切（重复步骤3），之后用至少20uL的水或者缓冲液回收双酶切的DNA。 |
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从琼脂糖凝胶里纯化DNA片段
说明
现在开发了有许多的从琼脂糖凝胶电泳里纯化分离的DNA的方法。这些方法允许这些特殊的，电泳分离的DNA片段用在进一步的分析和克隆操作。
从胶块里分离纯化DNA片段可以通过两个简单步骤完成。第一步，DNA从胶块里溶解出来。琼脂糖凝胶胶质通过一个有0.2到0.45uM膜的离心管，然后胶液（含有DNA）自由地流过。第二步，DNA片段用有合适MWCO值（见表三）足以截流DNA
的膜分离装置来浓缩洗脱，洗去污染物。这个方法比起标准的沉淀和透析的方法更加快捷和可靠（图七）。
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胶 块 -> 浸 软-> 用MF洗脱-> 紫外照相
图七 从琼脂糖凝胶里回收DNA片断。
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用一块0.8%的TAE（Tris，醋酸，EDTA）胶（未显示）电泳4ug商业化的1KB的DNA带普（Life
Technologies）。 挖出代表四个不同分子量带的胶块，冷冻，浸软，然后用0.2um的柱子离心。稀释含有DNA的滤液，并等分成四份。其中一份400ul，用1/10体积的醋酸钠和两倍体积的乙醇沉淀，－20℃2个小时，然后高速离心30分钟，干燥，重溶于20ul的TE里。其他的三份400ul离心通过100K的Nanosep膜（10分钟）或者其它的对照组的膜（20分钟），然后回收于20ulTE（2次10ul的洗涤）。样品在0.8％的Agarose
TAE胶里电泳，同时电泳1ug的1Kb的 Marker。相同的带浓度近似100%的回收。
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我们的数据显示用Nanosep 100K的装置回收的DNA从带的亮度看来，大于90％。四个不同的分子量带代表相互独立的试验。沉淀的DNA带也有很高的产率，但是会有很多胶缓冲液污染物，这些污染物不会出现在超滤的DNA样品中。其他对照组的装置的回收率普遍更不可靠，从0到80％。一种常见的对照装置常常有大约十分之一的不能很好的密封。
流程详细步骤
1、戴上手套，穿上试验服和抗紫外的面罩防止从透照仪的紫外线照射。
2、减少胶在透照仪的暴光时间，防止DNA损伤。
3、割出需要的DNA带，然后剔除多余的胶。在－20℃冷冻（可选，为了更高的得率）然后用枪头帮助浸软琼脂糖块。
4、加400ul的琼脂糖溶浆到一个Nanosep MF柱中（0.45或者0.2um）; 5000g离心5分钟。
5、从管底部收集滤液，然后65℃加热5分钟，灭活电泳或者处理胶时引入的DNA酶。
6、转移上一步的滤液到合适的MWCO柱子，然后5000g离心10到15分钟（表三）。高的转速会降低DNA的回收率。
7、（可选择）为了保证去除小分子，用100ul到400ul的100mM Tris/1mM的EDTA（TE）冲洗截留物，然后重复离心。
8、用枪头回收截留的样品。为了使回收率最大，用10ul到20ul的TE或者水，冲洗柱子上的截留物两次。用更大孔的枪头，防止剪切大于5Kb的片段。
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纯化、回收PCR产物
说明
PCR反应体系最后可能含有多达一微克的扩增DNA，在各种各样的分子生物学应用中使用。这些应用可能或多或少地对PCR反应混合物的残余物敏感。一些限制性酶，特别是DNA连接酶对DNA样品里存在的污染物特别敏感。因为PCR反应混合物里含有多种盐，游离的核酸，甘油，蛋白和引物，大多数的下游应用都要求对PCR产物进行某种纯化。
从缓冲液组分、游离核酸和引物中纯化PCR产物有多种的方法。
1、沉淀法，利用化学溶解性质选择性分离DNA。用这种方法纯化PCR产物主要的不足是花时间，而且不能完全除去共沉淀的缓冲液组分和杂质。
2、色谱法，用分子大小排阻的树脂或者亲和玻粉用PCR混合组分种纯化DNA。这一技术昂贵，通常需要大量的操作，样品从基质中冲洗下来后必需要浓缩。
3、超滤，涉及到用分子大小排阻的膜分离浓缩PCR产物（图十二）。这个方法快速，操作少，产率高，DNA不损伤，浓缩的DNA没有阻抑下游发应的污染物（图十三）。
流程详细步骤
1、避免吸到矿物油或者石蜡到后续步骤。油可以通过在－70℃下冷冻样品除去，然后把表面的液体移去，或者小心地用细口枪头从油面下面吸取样品，也可以成功地除去。
2、用水或者TE（10mM Tris/1mM EDTA,PH8）稀释反应混合物至500uL，然后转入一个30 或者100K
Nanosep柱中（表三）。
3、5,000g，离心10分钟（更高的速度将增加PCR产物的损失）。
4、（可选择）：为了进行不连续的恒容过滤，加入足够的缓冲液，使样品体积达到500ul，然后再离心。通常两轮稀释和浓缩将除去超过99％的盐和超过90％的小分子量杂质。如果需要更高的纯度，第三次重复稀释、浓缩步骤。多次的恒容过滤步骤会降低总得率；因此，质量和产率都需要考虑到。
5、用枪头回收截留的样品。为了得到最大的回收，可以用10到20uL的TE或者水，冲洗柱子。
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少量32P-dCTP加到有32P末端标记的引物的PCR反应混合物中（Life Technologies
公司）。反应在标准条件下进行30个循环。十个反应混合到一起，其中取100uL稀释到500uL，然后通过表征值（MWCO）Nanosep柱子离心。截留的物质用20uLTE回收，之后用10％的Tris硼酸聚丙烯酰胺胶（BioRad公司）电泳，然后用自显影分析。100K的Nanosep柱子显示它与PCR产物的最佳结合，并且引物和游离核酸的完全去除。如果为了保证除去缓冲液和游离地核酸而不是引物，那么30K和10K的膜可以截留PCR产物，同时除去缓冲液组分。如果pcr产物小于200bp，引物的存在不会阻抑下游的应用，可以用10K膜清洗。
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合并的PCR反应混合物分成两份。一份用1/10体积的醋酸钠和两个体积的乙醇沉淀，-20℃冷却两个小时，高速离心30分钟，用70％的乙醇洗，空气干燥，然后用40uL的水，重悬。第二份稀释至500uL，然后通过30K离心15分钟。截留的物质用40ul重溶，然后分成10uL的等分，用于分析。一份电泳，用作未酶切对照（UC），其它的样品按照生产商的说明稀释到20uL的酶切反应体系（Ecor1＝R1，BamH1＝BH1，Xba1＝Xba）。这些样品在37℃酶解30分钟，用1.5％的琼脂糖胶电泳，DNA带用溴乙锭染色观察。我们的数据清楚地表明，Xba1酶不能完全酶切沉淀来的400bp的PCR片断。相比之下，用30K膜快速纯化的样品可以用Xba1完全酶解，这表明使用这个膜除去的杂质会影响酶切反应。
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提高从稀溶液里回收蛋白质的产率
说明
对每一种稀蛋白质溶液来说(<10ug/mL),用超滤膜浓缩回收物常常是不定量的(图一)。玻尔公司吉尔曼实验室的离心装置是用特殊的材料构成的,这种材料使非特异吸附最小化。
但是,某些蛋白,特别是稀的时候,会有问题。非特异结合的程度随着个别蛋白的结构的不同而不同。 含有带电的或者疏水结构域的蛋白质倾向于表现对可以导致不可逆结合的不同表面的高亲和力。
降低蛋白质在表面的吸附性的损失的策略既在于表面的预先处理以填满暴露的位点又在于改变溶液的构成，例如加入蛋白（常常是清蛋白），去垢剂，或者盐。在大多数情况下，在浓缩稀蛋白溶液之前预处理(钝化)柱子可以提高回收率（图五）。
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未处理 1％BSA 5％SDS 5％Tween
0.1ug/mL和1.0ug/uL的牛血清白蛋白（BSA）溶液通过预处理过的30K
Nanosep柱子。预处理包括用1％的牛血清白蛋白，5％的十二烷基磺酸钠（SDS），或者5％的Tween－20浸浴柱子一个小时。然后淋洗柱子，马上使用。钝化会增加蛋白的回收，特别是大多数的稀样品。
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流程详细步骤
1、 加入500uL灭菌的钝化溶液到Nanosep柱子（见下）。然后盖上盖子，然后在室温下让柱子在溶液种浸浴至少一个小时。
钝化溶液
 1％牛血清白蛋白磷酸缓冲液溶液
5％十二烷基磺酸钠蒸馏水水溶液
5％Tween-20非离子活性剂蒸馏水溶液
5％Triton-X
蒸馏水溶液
5％聚乙二醇化合物蒸馏水溶液
1％免疫球蛋白IgG磷酸缓冲液溶液
2、 倒出或者吸取出柱子里的钝化溶液，然后用灭菌的蒸馏水完全冲洗一下Nanosep柱子。
3、为了保证除去残留的钝化溶液，加500uL的蒸馏水到柱子里，然后1,4000g离心5到10分钟。丢弃滤液。
4、柱子能够马上使用，或者保存以后用。如果柱子要以后用，加100uL灭菌的蒸馏水到样品槽，然后保存在4℃以延迟细菌的生长。
重要提示：一旦膜钝化以后，不能让膜干了。 |
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上海：上海市遵义路100号虹桥上海城A栋1203室。
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