NPTN基因新生(de novo)变异导致以自闭症和智力发育障碍为特征的神经发育性疾病——神经塑形蛋白(neuroplastin, Np)-质膜Ca2+-ATP酶(PMCA)功能低下(hypofunction)机制

《Genome Medicine》：De novo variants in NPTN cause a neurodevelopmental disorder with autism and neuroplastin-PMCA hypofunction

　　

背景：NPTN编码人神经塑形蛋白(human neuroplastin, hNp)，系免疫球蛋白(Ig)超家族I型跨膜糖蛋白，为质膜Ca2+-ATP酶(plasma membrane Ca2+-ATPase, PMCA)的必需结合亚基。hNp及hNp-PMCA复合物在人脑中的重要性尚不清楚。方法：研究人员报道伴自闭症及轻至重度发育迟缓(DD)/智力障碍(ID)个体中的NPTN de novo变异，并采用动物模型及计算机模拟(in silico)、分子与细胞手段评估其效应。结果：4例个体携带影响hNp55与hNp65两种异构体的变异，另4例仅影响hNp65异构体；2例独立携带相同无义(nonsense)功能缺失(loss-of-function)变异，预计引起所有hNp异构体单倍剂量不足(haploinsufficiency)。Nptn+/–单倍剂量不足小鼠Np与PMCA表达降低并表现社交行为改变。神经元中Np55/65生成不足致PMCA表达及功能下降。2个错义(missense)变异引起特定结构与热力学异常及HEK细胞中hNp低表达。原代神经元中上述hNp变异无法调节胞质Ca2+瞬变(transient)。果蝇中影响PMCA相互作用的错义突变不能挽救hNp直系同源物缺失所致的致死表型。结论：研究人员表明，一种以ID和自闭症为特征的新型神经发育性疾病源于NPTN基因单倍剂量不足或突变hNp功能不全相关的PMCA功能低下。

论文解读：NPTN de novo变异致神经发育障碍伴自闭症及神经塑形蛋白-PMCA功能低下机制

研究背景与意义

发育迟缓(developmental delay, DD)、智力障碍(intellectual disability, ID)及孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)具有高度临床与遗传异质性，约40%–60%病例病因未明，de novo变异是重要致病因素。NPTN基因编码脑特异性表达的免疫球蛋白(Ig)超家族I型跨膜糖蛋白——神经塑形蛋白(neuroplastin, Np)，经可变剪接产生hNp55（含Ig样结构域II–III）和神经元特异性hNp65（含Ig样结构域I–III）两种主要异构体。Np是质膜Ca²⁺-ATP酶(plasma membrane Ca²⁺-ATPase, PMCA1–4)的必需结合亚基与稳定因子，Np–PMCA复合物通过超快泵出胞质Ca²⁺维持静息Ca²⁺水平及调控突触后Ca²⁺信号，并参与设置NMDA受体激活所需的突触周碱性微环境。既往Nptn全身敲除小鼠显示认知缺陷与社交行为异常，但NPTN de novo变异与人类神经发育性疾病及自闭症的直接因果关系、致病机制（单倍剂量不足 vs. 显性负效错义变异致Np–PMCA功能低下）尚未见报道。本研究首次在伴ASD与DD/ID的临床队列中发现NPTN致病性de novo变异，通过多层次实验验证其导致以ID和ASD为特征的新型神经发育性疾病，机制为NPTN单倍剂量不足或突变hNp功能不全引起Np–PMCA复合体功能低下(Np-PMCA hypofunction)及神经元胞质Ca²⁺调节障碍，论文发表于《Genome Medicine》。

主要技术方法概述

研究人员通过GeneMatcher国际匹配收集8例伴DD/ID和ASD的个体，行三人(trio)全外显子组测序或先证者全外显子组测序鉴定NPTN de novo变异（参考转录本NM_012428.4，ACMG分类），gnomAD v4.1.1过滤。采用CADD、REVEL、MutPred2等工具进行错义变异有害性预测。通过分子动力学(molecular dynamics, GROMACS)与蛋白–蛋白对接(HADDOCK)分析错义变异对hNp65结构及hNp–PMCA相互作用的影响。构建野生型及突变型hNp55/hNp65表达载体，转染HEK293T细胞行Western blot检测hNp及共转hPMCA2的表达量；原代大鼠海马神经元敲低内源性Np（siRNA）或过表达野生型/突变型hNp，行GCaMP5G/GCaMP7s钙成像(calcium imaging)检测电刺激诱发胞质Ca²⁺瞬变的峰值振幅、半宽及衰减时间。利用果蝇(Drosophila melanogaster)肌肉特异性dBsg(dsRNA knockdown)模型评估hNp55^wt与hNp55^P226L对致死表型的挽救能力。采用Nptn^+/–单倍剂量不足小鼠，免疫荧光定量海马CA1区Np与PMCA1–4表达，三箱社交互作测试(three-chamber test)评估社交行为。

研究结果

Clinical and genetic analysis（临床与遗传学分析）

8例个体（7例确认de novo，1例先证者未测父母）均表现为DD/ID（轻–重度）及ASD（7/8例确诊），部分伴癫痫、小脑蚓部发育不全、轻度特殊面容。Trio-WES鉴定2个错义及5个预测功能缺失(predicted loss-of-function, pLoF)变异（无义、移码），包括2例独立携带相同无义变异c.14C>A(p.S5)，均不在gnomAD。变异分别位于影响hNp55+hNp65（外显子1/6共有外显子或p.S5）或仅影响hNp65（外显子2特异性变异）。临床严重程度趋势提示：影响两异构体者DD/ID偏重（重–中度），仅影响hNp65者偏轻（中–轻度），但存在个别例外。

Characterization of the NPTN variants（NPTN变异特征分析）

NPTN含8个编码外显子，可变剪接外显子2决定hNp65特异性Ig-I结构域。错义变异c.403T>A(p.W135R, hNp65 Ig-I结构域保守Trp)与c.1025C>A(p.P342L, hNp65 transmembrane domain及对应hNp55 p.P226L)位于物种间高度保守区；p.P342L位于hNp跨膜域直接参与PMCA跨膜螺旋TM10相互作用的关键Pro残基。pLoF变异致提前终止密码子，预计经无义介导降解(nonsense-mediated decay, NMD)引起单倍剂量不足或截短无功能蛋白。

Computational analysis of the NPTN missense variants（NPTN错义变异的计算分析）

分子动力学显示p.W135R破坏hNp65 Ig-I F-G环构象及trans-同嗜性(trans-homophilic)二聚化界面的关键残基空间排布，提高结合自由能(ΔG binding)，削弱同源二聚化。p.P342L将跨膜域保守Pro替换为Leu，破坏hNp跨膜螺旋与PMCA1/2 TM10 W1043间的最佳相互作用距离与热力学适配，通过蛋白–蛋白对接预测hNp^P342L–PMCA结合亲和力下降，表明该错义变异特异性损害Np–PMCA相互作用。

Expression of NPTN missense variants and effects on PMCA levels（NPTN错义变异表达及对PMCA水平的影响）

HEK293T中转染显示hNp65^p.W135R和hNp65^p.P342L蛋白表达显著低于hNp65^wt（p.W135R p<0.001，p.P342L p=0.033），hNp55^p.P226L与hNp55^wt相当。共转hPMCA2时，野生型hNp55/65显著提升PMCA2水平，而hNp65^p.W135R、hNp65^p.P342L及hNp55^p.P226L促进PMCA2表达的能力均显著减弱（p.P342L p=0.004，p.W135R p=0.011 vs. 对应野生型），证实错义变异损害Np稳定PMCA的作用。

Effect of NPTN missense variants on cytosolic Ca²⁺regulation（NPTN错义变异对胞质Ca²⁺调节的影响）

原代海马神经元钙成像显示：过表达hNp65^wt/hNp55^wt降低诱发Ca²⁺瞬变峰值并加速基线恢复；hNp65^p.W135R与hNp55^p.P226L虽降低峰值但与野生型过表达相比，Ca²⁺瞬变半宽延长、90%衰减时间减慢（p.W135R 衰减 p<0.0001 vs. hNp65^wt；hNp55^p.P226L衰减 p<0.01 vs. hNp55^wt），提示胞质Ca²⁺清除受损；hNp65^p.P342L峰值降幅不及野生型但衰减恢复接近野生型，反映跨膜域错义变异主要损害PMCA结合/稳定而非全部Np功能。Np敲低(siRNA)使神经元内源性Np与PMCA降低约50%，Ca²⁺瞬变衰减延缓，模拟单倍剂量不足效应。

Lethality due to dBsg-KD during early muscle development is rescued by hNp55 but not hNp55^P226L（果蝇dBsg敲低致死可被hNp55^wt挽救而hNp55^P226L不能）

果蝇单一Np直系同源dBsg(dBasigin)肌肉特异性敲低致胚胎–L1期致死；共表达hNp55^wt完全挽救至成虫期，而hNp55^P226L几乎无挽救（均死于L2前），证实P226L错义变异使hNp55丧失功能互补能力，支持其为功能缺失性致病变异。

Np-PMCA hypoexpression and social behavior in Nptn^+/–mice（Nptn^+/–小鼠Np-PMCA低表达与社交行为）

Nptn^+/–小鼠海马CA1区Np免疫荧光强度降约50%，PMCA1–4同步降约45%。三箱社交测试：Nptn^+/–与野生型均偏好陌生鼠胜空杯（阶段2），但阶段3引入第二陌生鼠时，Nptn^+/+偏好新陌生鼠胜熟悉鼠，Nptn^+/–无此偏好（无显著性差异），表现为社交新奇识别缺陷——自闭症相关内表型(endophenotype)。提示NPTN单倍剂量不足致Np–PMCA复合体减少与社交互动异常。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出：本队列NPTN de novo变异（无义、移码致单倍剂量不足；错义致hNp低表达及Np–PMCA相互作用/稳定功能受损）共同导致神经元Np–PMCA复合体功能低下与胞质Ca²⁺调节异常，是ID与ASD共病的致病机制；p.W135R还可能影响hNp65 trans-同嗜性作用及TRAF6依赖的突触发生，p.P342L/p.P226L特异地破坏Np跨膜域与PMCA结合。Nptn^+/–小鼠海马Np与PMCA共降低及社交新奇偏好缺失为NPTN单倍剂量不足致ASD样行为提供体内证据。与ATP2B1–4(编码PMCA) de novo变异所致神经发育表型相呼应，确立NPTN–PMCA轴在大脑发育中的核心地位。本研究发现NPTN缺陷个体暂未表现耳聋，可能与年龄较小残余Np55足以维持耳蜗毛细胞功能或退变尚未显现有关。

结论（翻译自原文Conclusions）：研究人员确定NPTN的de novo变异是一种以智力障碍和自闭症为特征的新型神经发育性疾病的致病原因。基于本文及文献证据，研究人员提出该病部分归因于突变或不足的神经塑形蛋白–质膜Ca²⁺-ATP酶(neuroplastin-PMCA)复合体功能低下或表达不足。