《Viruses》：Next-Generation Sequencing in Practical Wildlife Disease Investigation: Metagenomic Insights into European Bison and Gazelle Mortality and Morbidity Events
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野生动物疾病调查需要能够检测多样化且此前未被识别病原体的诊断方法。研究人员将宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）应用于来自三只遭受突发死亡的瞪羚（Gazella dorcas osiris
野生动物疾病调查需要能够检测多样化且此前未被识别病原体的诊断方法。研究人员将宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）应用于来自三只遭受突发死亡的瞪羚（Gazella dorcas osiris）和四只患有呼吸系统疾病或坏死性龟头包皮炎（necrotic balanoposthitis，NBP）的欧洲野牛（Bison bonasus）的样本。在瞪羚中未检测到优势细菌物种。在欧洲野牛中，呼吸系统疾病与多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）相关，而NBP样本则以Porphyromonas levii和其他厌氧菌为主。瞪羚样本主要含有致病意义未定的逆转录病毒科（Retroviridae）相关序列。副痘病毒（Parapoxvirus）相关注释未被聚合酶链反应（PCR）证实，提示存在非特异性或宿主相关的序列相似性。马卡病毒（Macavirus）相关序列与之前的PCR结果一致，并使得一个分歧型γ疱疹病毒基因组的约51.1 kb片段得以重建。这些发现证明了mNGS在野生动物疾病调查和基因组监测中的价值，同时强调了对宏基因组分类学分配进行独立验证的必要性。
**宏基因组测序在野生动物疾病调查中的实践：欧洲野牛与瞪羚发病及死亡事件分析**
### 一、研究背景与目的
野生动物疾病暴发常由多种已知或未知病原引起，且现场样本质量往往不佳。传统诊断手段如靶向PCR、培养、组织病理学和血清学，在面对混合感染、新发病原或降解样本时存在明显局限。欧洲野牛（Bison bonasus）作为欧洲最大的陆生哺乳动物，遗传多样性低、易感多种传染病；圈养瞪羚（Gazella dorcas osiris）则面临跨种传播和环境应激等威胁。这些物种的疾病事件对保护生物学、动物园医学和跨界疾病监测具有重要意义。宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）可在不预设病原体种类的情况下同时检测细菌、病毒、真菌和寄生虫核酸，为野生动物疾病的无偏调查提供了新途径。然而，其在常规野生动物疾病调查中的实际应用报道仍然较少。本研究旨在通过分析三个独立疫情事件中的瞪羚和欧洲野牛样本，评估mNGS在野生动物发病与死亡事件调查中的价值。
### 二、研究设计与方法概述
样本来源于波兰三个疫情调查事件：一是扎莫希奇动物园三只突发死亡的瞪羚，采集血液（A123K、A126K、A158K）、鼻拭子（A126N）和脾脏（A123S）；二是普什奇纳围场两只患坏死性龟头包皮炎（necrotic balanoposthitis，NBP）的欧洲野牛，采集包皮组织（A1018、A1019）；三是克内申斯卡森林两只野外死亡欧洲野牛，采集肺组织（A1162、A1163）。经DNA提取和质量控制后，构建350 bp插入片段文库，在Illumina NovaSeq X Plus平台进行PE150测序。对欧洲野牛数据用Bowtie2比对参考基因组（GCA_963879515.1）去除宿主序列；瞪羚因缺乏合适参考基因组而未去除宿主读段。用MEGAHIT组装、GeneMark.hmm预测基因、CD-HIT去冗余，DIAMOND比对MicroNR数据库，MEGAN的LCA算法进行物种分类。对候选病毒序列采用BLASTN比较作图、基因组重建和系统发育分析，并用PCR验证疱疹病毒和痘病毒。
### 三、主要研究结果
**病毒学调查**
基于属水平病毒注释计数，瞪羚样本的病毒基因注释数（3859–3913）远高于欧洲野牛（15–18）。瞪羚中逆转录病毒科（Retroviridae）相关注释最多，可能源于内源性逆转录病毒元件，致病意义不明。副痘病毒（Parapoxvirus）相关注释在瞪羚和欧洲野牛中均有检出，但在欧洲野牛中全部注释为羊口疮病毒（ORFV）。进一步的BLASTN比对仅匹配ORFV D1701参考基因组（HM133903.1）的两个局部区域，涉及PP1、PP287和PP288三个蛋白编码区；针对vIL-10和GIF基因的ORFV特异性PCR均为阴性，且其中一个匹配区域与哺乳动物基因组序列高度相似，提示这些注释可能来自宿主序列的交叉同源性，而非真正感染。相比之下，瞪羚样本中检测到的马卡病毒（Macavirus）相关序列与先前泛疱疹病毒PCR结果一致。以样本A126N为对象，研究人员利用与Macavirus sp. isolate pool43（PV553530.1）等参考序列的比较作图，重建了部分γ疱疹病毒基因组，命名为Gazella dorcas gammaherpesvirus 2 isolate PL/2023/Zamosc/dorcas/3B/GDGHV2（GenBank登录号PZ867132）。该重建覆盖参考坐标系（97,548 bp）的52.4%（51,140 bp），包含16个注释CDS；原始读段作图显示所有CDS均被完全覆盖，平均读深469–551×。基于DNA聚合酶（666 bp）、糖蛋白B（692 bp）和解旋酶（396 bp）三个片段构建的邻接系统发育树均将该病毒置于与蓝小羚羊Macavirus sp. isolate pool43密切相关的独特谱系，自展支持率分别达到100%、100%和98%。
**细菌宏基因组学**
物种水平注释显示，瞪羚样本间细菌谱系相似，优势菌包括空肠弯曲杆菌（Campylobacter coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、尿道气球菌（Aerococcus urinae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）等，但未检测到单一优势病原菌；这些菌群与肠道和上呼吸道相关，可能源于死后细菌易位和过度生长。欧洲野牛样本细菌注释较少且异质性更大。NBP样本以Porphyromonas levii为主，伴有Peptoniphilus ovalis、Peptoniphilus sp. ING2D1G和Neofamilia massiliensis等厌氧菌，符合慢性坏死性软组织感染的多种厌氧菌共生特征，但此前未在NBP病例中描述。肺炎死亡野牛样本则显著以多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）为主，支持其作为致死性呼吸道疾病候选病原；其他环境相关菌属（如Sphingobacteriia bacterium、Asinibacterium sp.等）仅少量检出，可能为环境污染或死后易位。
### 四、讨论与结论
讨论部分指出，mNGS在病因复杂的NBP调查中具有独特价值。欧洲野牛NBP自20世纪80年代以来一直病因未明，传统方法未能一致分离出原发病原。本研究发现Porphyromonas levii等厌氧菌在病变中占优势，提示这些菌群可能促进病变进展而非原发病因，病毒等其他因素或许参与疾病启动。对瞪羚死亡事件的病毒注释解读需谨慎：由于缺乏宿主参考基因组，内源性逆转录病毒序列未能从非宿主读段中去除，导致逆转录病毒注释过高；副痘病毒注释则展示了自动化宏基因组分类的陷阱——宿主来源序列与病毒参考基因组局部相似可造成假阳性，需通过全基因组覆盖作图或独立PCR进行验证。Macavirus的系统发育证据则增强了先前PCR发现的可靠性。肺炎样本中多杀性巴氏杆菌的优势与已知的野生动物巴氏杆菌病环境诱因（如气候应激）相一致。
研究结论可概括为：宏基因组测序展示了作为野生动物疾病暴发调查工具的潜力，能够同时检测病毒和细菌病原；但解释结果时需考虑宿主序列去除不足、丰度估计的相对性、基于参考序列分类可能出错等局限，且测序对照的缺乏不能完全排除污染。尽管存在这些限制，该方法仍为瞪羚中先前发现的Macavirus提供了进一步分子证据并实现了基因组部分重建，区分了欧洲野牛肺炎和NBP的不同细菌群落，并为这些疾病的多因素病因提出了新假设。mNGS有望补充传统诊断手段，提升野生动物种群的疾病诊断和病原监测能力。
