热力学耗散约束单细胞代谢多样性：跨域生长的能量成本守恒与有氧呼吸的效率权衡

本研究针对代谢多样性如何受热力学约束这一长期未解问题，整合了跨越数十年的化能营养生长实验数据，通过非平衡热力学框架计算能量耗散。研究发现两个经验规则：单位生物量生长的能量耗散（α≈500 kJ Cmol-1）在不同代谢类型和生命域中高度保守；有氧呼吸存在耗散与生长的权衡（β≈-500 kJ Cmol-1），体现了其高热力学效率。该研究揭示了耗散对代谢多样性的严格约束，为理解生命能量转换提供了定量基础。

　　

生命的一个基本特征是其在不同生物环境中的普遍存在。这种普遍性的核心是细胞代谢，这是一个相互连接的化学反应网络，将环境营养物质转化为支持生长的物质和能量。代谢具有高度多样性，体现在生命分布在各种营养类型、温度和其他物理化学参数的环境中。由于代谢维持的物质和能量流使细胞远离热力学平衡，长期以来人们认为热力学第二定律对生命施加了基本约束。然而，远离平衡时，通量与它们耗散的自由能之间没有一般关系。因此，尽管付出了显著的努力，关于热力学与代谢之间相互作用的知识仍然很少。是否存在一般的定量规则，通过代谢耗散的自由能来约束代谢的多样性？

在过去的几十年里，代谢研究反映了分子生物学的巨大进步，并集中在基因组规模的代谢网络上。相比之下，早在一个世纪前就有的研究通过细胞与环境交换的底物和产物来描述细胞生长。这种宏观方法通过“宏观化学方程”来识别代谢类型，例如葡萄糖呼吸的C₆H₁₂O₆ + O₂ + NH₃ → CO₂ + H₂O，这足以对稳态单细胞生长进行热力学描述。代谢多样性体现在代谢类型中各种电子供体和受体的多样性，以及每个类型内生长的扰动。这种宏观方法在生物技术和生态学中的应用旨在预测生物量产量和效率，但忽略了代谢的多样性（不同途径）以及对环境变化的可塑性响应（替代途径的激活）。因此，探索代谢多样性的热力学约束需要超出单个研究组能力的细胞生长实验。

在这项工作中，我们将非平衡热力学形式应用于发表的测量数据，这些数据跨越了八十年，涵盖了化能营养生活的所有领域的一百多种代谢类型。此外，它包含了70多种微生物物种和每种类型的各种物理化学条件，因此构成了研究热力学与代谢多样性之间相互作用的理想资源。为了评估该数据集的质量，我们验证了三个关键物理原理：元素守恒、热力学第一定律和热力学第二定律。

元素守恒用于估计未测量的产量。为了验证这种方法，我们将每电子供体的底物和产物的估计产量y与这些相同产量的直接测量值进行了比较。图1a显示了69种不同产量的散点图，这些产量来自56个实验，可以进行此类验证。一致性良好，最大偏差对应于小的产物产量，这些通常难以准确测量。

热力学第一定律确立了焓交换与热交换之间的等式。因此，我们可以通过比较预测的焓净交换与直接量热测量的热来验证我们的热力学方法，两个量都按生长的生物量进行归一化。图1b显示了包含量热测量的数据子集（98个实验）的这种比较。与之前一样，预测和测量的每单位合成生物量的热交换之间存在普遍一致性。

最后，我们验证了热力学第二定律。对于数据集的每个实例，我们计算了每消耗电子供体的自由能耗散。我们发现在超过99%的数据中存在自由能的净耗散，符合第二定律。我们丢弃了剩余的数据点以进行进一步分析。

在建立了数据集的质量后，我们开始研究生理和热力学生长参数之间的相互作用。

生长的一个关键生理参数是生物量产量y，它量化了每消耗电子供体产生的生物量。生物量以碳摩尔（Cmol）为单位，这是包含一摩尔碳原子的干生物量。图2a显示了整个数据集中y的变异性。产量变异性跨代谢类型跨越三个数量级。我们提醒读者，代谢类型定义为代谢的特定底物和产物集合，例如葡萄糖呼吸是一种代谢类型，葡萄糖发酵是另一种类型。与跨类型产量的巨大变异性相比，类型内的变异性跨度不到两倍。这种类型内的变异性反映了实验条件（如温度、稀释率或pH）、单细胞物种和实验不确定性的变化。数据集中的最低产量y≈10^-2 Cmol mol^-1对应于自养产甲烷作用，这是一种古老的古菌代谢类型，在缺氧环境中从CO₂和分子氢合成生物量和甲烷。最高产量y≈10 Cmol mol^-1由二糖（如蔗糖和乳糖）的呼吸产生，接近其碳限制12 Cmol mol^-1（电子供体中存在的碳原子数）。

为了解释生长的热力学，我们量化了每消耗电子供体的自由能耗散σ（以下简称耗散）。与产量的情况一样，我们发现σ变化很大，也跨越了三个数量级（图2b）。它同样以自养产甲烷作用为下界，σ≈50 kJ mol^-1，从碳的最氧化形式CO₂合成生物量；以及糖的呼吸为上界，σ≈6 MJ mol^-1，这些是高度还原的电子供体。相比之下，除了由于代谢类型变化带来的区别之外，古菌、原核生物和真核生物之间在y或σ上没有发现明显的区别。类似地，温度和pH对y没有系统性影响。因此，数据表明产量和耗散的变异性主要由跨代谢类型的变化主导。

为了研究热力学与单细胞生长生理学之间的关系，我们将耗散对产量作图（图3a）。两个显著特征变得明显：首先，产量和耗散在三个数量级的跨度上强烈相关；其次，对应于相同代谢类型的数据在遵循独特趋势的准线性空间中聚集在一起。这两个观察结果表明，将耗散分离为特定代谢类型的平均贡献σ?和由于类型内变异性引起的小偏差δσ，产量类似地分为?和δy（图3a插图）。为了简化 notation，我们省略了这些变量对类型的显式依赖。

绘制跨类型的平均耗散对平均产量，我们发现它们线性比例（图3b）。当轴以每克或每碳摩尔表示时，这种相关性仍然存在，尽管范围较小。因此，我们定义系数α = σ? / ?，它量化了某种代谢类型生长的耗散成本。如前所述，我们不写出α对类型的显式依赖。这个成本，根据第二定律必须（并且是）为正，测量了每生长生物量的自由能损失。具有小截距的线性关系意味着α在不同代谢类型之间是保守的。成本α的中值约为500 kJ Cmol^-1或每固定碳原子8个ATP当量，四分位距为350 kJ Cmol^-1。这个α值与先前假设的用于预测生物工程文献中生物量产量的常数一致。然而，它比生物物理估计大，表明细胞内过程的簿记忽略了耗散的重要贡献。成本α是保守的，与物种、生命领域、生长速率或其他物理化学变量无关，呈现了对代谢多样性的整体约束。

在给定类型内，偏差δσ与δy线性相关。这是元素守恒的直接结果，用于从测量的产量计算耗散。与跨类型观察到的σ?和?之间的单一经验趋势相反，在每个类型中δσ与δy相关的斜率确实在不同类型之间变化很大。有氧类型具有陡峭的负斜率，而厌氧类型具有浅的负斜率（图3c）。为了量化趋势的多样性，我们通过以下线性回归在每个代谢类型内定义一个系数β：δσ = β δy。系数β解释了耗散的变化如何相对于类型内产量的变化进行调整。我们在所有实例中发现β < 0，因此产量的增加伴随着耗散的减少。对于厌氧类型，我们发现β≈-100 kJ Cmol^-1，因此产量可以增加而耗散影响很小。对于有氧类型，我们发现β≈-500 kJ Cmol^-1，因此产量和耗散之间存在显著的权衡：产量的相对增加50%导致耗散的 comparable 减少（图3c，虚线）。总之，虽然生长的耗散成本（由α量化）在代谢类型之间是保守的，但类型内的偏差（由β量化）区分了有氧和厌氧类型。

为了评估成本守恒的程度，我们将其分解为三个项：与底物吸收的自由能；与产物释放的自由能；以及存储在生物质中的自由能（图4a）。每个项为成本变异性提供了参考。

跨代谢类型，每生产生物质吸收的自由能高且可变，中值为900 kJ Cmol^-1，四分位距为2700 kJ Cmol^-1（图4a，第二个方框）。类似地，与产物释放的自由能也高且可变，中值为1500 kJ Cmol^-1，四分位距为2700 kJ Cmol^-1（图4a，第三个方框）。相比之下，生物质的自由能含量大约低一个数量级（图4a第四个方框）。我们得出结论，成本α主要由通过底物和产物交换的自由能主导。值得注意的是，虽然这些交换大且可变，但α较低且表现出相对较低的变异性：中值470 kJ Cmol^-1，四分位距350 kJ Cmol^-1（图4a第一个方框，以及直方图插图）。因此，成本在广泛的进口和出口自由能范围内是守恒的（图4b，c）。

α变异性低的原因是，虽然吸收和释放的自由能都大且可变，但它们强烈相关并相互补偿（图4d）。这种补偿源于元素守恒和化学物质的自由能之间的相互作用，我们将在以下部分中解开。总之，虽然流经细胞的自由能在不同代谢类型之间变化显著，但自由能流入和流出的补偿导致了生长的耗散成本守恒。

由于代谢的多样性，许多电子供体可以有氧和厌氧代谢。为了研究这种现象的热力学，我们根据电子供体和受体对代谢类型进行分组，并确定了30对使用相同电子供体有氧和厌氧的组。例如，一对包括一组用氧气呼吸乙醇的代谢类型，和一组用硫酸盐呼吸乙醇的代谢类型。有氧组完全是呼吸性的，使用氧气作为电子受体，而厌氧组包括发酵和厌氧呼吸，因此使用各种除氧气外的电子受体。我们发现，虽然在每对中，有氧组的产量和耗散通常更高（图5a，b），但跨此转换的成本变化没有明显趋势（图5c）。此外，无论是对应于不同物种（例如Candida utilis与Desulfococcus propionicus呼吸乙醇）还是同一物种的可塑性变化（例如E.coli呼吸或发酵葡萄糖），这都是正确的。因此，无论是进化还是可塑性，从厌氧到有氧代谢类型的转换保留了电子供体，并比例地增加耗散，满足守恒成本α的约束。

相反，这种转换的热力学特征在于耗散如何相对于代谢类型内的产量进行调整。这由系数β描述，即由元素守恒引起的耗散和产量之间线性关系的斜率。图5e-g显示了三个厌氧/有氧对的耗散和产量偏差的散点图， exemplifying 一般规则，图5h显示了一个代表例外的对。正如一般情况所示，有氧类型表现出耗散和产量之间的显著权衡，而非有氧类型的相同电子供体则没有。厌氧和有氧类型之间β的这种差异扩展到几乎所有对（图5d）。因此，从厌氧到有氧代谢的转换保留相同的电子供体，允许用耗散换取产量。

我们确定了这个规则的几个例外：执行厌氧呼吸的代谢类型，使用硝酸盐等电子受体， among few others（图5d，h）。那些异常值具有与有氧类型相似的β值。总体而言，我们得出结论，从厌氧类型过渡到有氧类型的热力学含义主要在于耗散-产量权衡的出现。

到目前为止，我们已经确定生长的耗散成本在类型之间是保守的，并且耗散和产量偏差之间的权衡伴随有氧呼吸。我们现在按照远离平衡的热力学形式来描述这两个代谢特征。首先，我们注意到细胞耗散由产量y_i及其相应自由能μ_i的乘积之和给出。然而，正如已经预期的，由于元素守恒施加的约束，这些产量在代谢类型内不是独立的。

为了解开这些约束，我们将耗散分解为仅独立贡献。每个贡献是一个独立产量（例如生物质、电子供体等）与广义热力学力r_i的乘积。热力学力r_i量化了驱动维持生长的相应通量的自由能差。每个力包含依赖底物和产物化学势的线性组合，系数由代谢类型的化学计量决定。因此，我们可以将每电子供体的耗散写为独立产量的函数：σ = r_ed - r_b y + Δ，其中Δ = Σ_ii∈sb y_ii r_ii - Σ_ii∈pd y_ii r_ii，i_i仅跨越生物质和电子供体以外的独立底物和产物产量子集。在每个代谢类型内，力r_i是相同的，最多由于生物质组成和温度校正而有微小偏差，但可以从类型到类型任意变化。

数据库中大约一半的代谢类型只有一个独立产量，即生物质产量y，因此Δ=0。此外，我们发现对于大多数剩余数据，Δ可以忽略。因此，我们确定了代谢的两个主导热力学力：电子供体力r_ed，与电子供体流入耦合；和生物质力r_b，与生物质合成耦合。我们凭经验发现r_ed是正的，并且很好地近似了跨类型的平均耗散，σ? ≈ r_ed。相比之下，我们发现合成代谢力反对耗散，-r_b < 0，并且由于元素守恒大约等于系数β，即β ≈ -r_b（图6c）。由于其符号的结果，合成代谢力可以被理解为生长的反对力。r_b和β之间的等价允许将有氧代谢中耗散和产量之间的权衡追溯到二氧化碳的大而负的自由能含量。因此，耗散由两个相反的力主导，分解代谢和合成代谢，证实了细胞生长受自由能转导原理支配的观点。

耗散分解为独立项，进一步允许按照ref. 42定义生长的热力学效率η（见补充信息F3）。直观地，效率测量独立通量产生和消耗的自由能之比。在我们的案例中，独立通量主要由生物质生产和电子供体消耗主导，因此η ≈ -y r_b / r_ed，这可以理解为合成代谢与分解代谢耗散之比。图6d显示有氧类型比厌氧类型具有高得多的效率。这是因为，由于之前建立的关系，我们有η ≈ -β / α（图6b，c显示了这个近似的质量）， together with the finding that -β is larger for aerobic types results in their high efficiency. 因此，尽管有氧生物质合成受到更大的热力学力反对，有氧代谢更高效。我们 remark that different definitions of growth efficiency have been proposed in the literature. 如此处定义，η明确考虑了化学计量约束，并将本工作中观察到的经验规则结合到一个量中。重要的是，我们的定义不同于ATP产量的常见概念，后者计算每分解代谢电子供体产生的净ATP分子数（例如，葡萄糖呼吸和发酵分别约为32和2）。

表征单细胞生长的代谢多样性受到两个经验规则的热力学约束。首先，生物质的非平衡成本α在代谢的适应性和可塑性变化中大致守恒；其次，有氧代谢导致耗散和产量偏差之间的权衡，系数为β。第二条规则涉及β的值，即由代谢类型内元素守恒施加的线性关系的斜率。第一条规则是跨类型的观察，因此与化学计量约束无关。这些规则由两个独立的热力学力r_ed和r_b控制，分别与分解代谢和合成代谢相关。分解代谢和合成代谢项的反向符号意味着细胞生长通过自由能转导发生，类似于化学能转化为机械功 in cells。生长的热力学效率η的定义允许定义单细胞生长的效率，主要由β和α的比率主导，有氧代谢类型 consistently higher。

偏离两个热力学规则 singled out 特殊代谢类型。例如，古菌中的氢营养产甲烷作用（图3中的橙色十字）的成本比典型值高三倍，偏离第一条规则。同样，硝酸盐的厌氧呼吸可以具有与有氧类似的合成代谢反对力和热力学效率，因此偏离第二条规则。有趣的是，这些代谢类型在生命起源、真核生物发生和有氧代谢进化理论中扮演核心角色。最后，一种 also exceptional 吸热代谢类型的存在（图1b插图）证明化学熵可以是耗散的主要来源。热或化学熵在多大程度上主导耗散仍然是一个重要的开放问题。

我们的数据收集和处理建立在微生物生长能量学数十年研究的基础上。早期研究旨在通过预测生物量产量来自电子供体特性（如其还原度）来控制生物反应器中的微生物过程。后来的元分析提出了电子供体特性与生长耗散成本之间更复杂的经验关系； “分解代谢反应”自由能与生物量产量之间的相关性；以及由于非标准条件的热力学校正。值得注意的是，还有人提出生长耗散成本的常数值导致生物量产量的良好预测因子。我们的工作通过关键区分类型内和跨类型的变异性，并将一般非平衡热力学框架应用于扩展和验证的数据集，显著推进了这些努力。例如，r_ed将“分解代谢耗散”的概念推广到复杂代谢类型；r_b提供了与细胞内过程无关的“合成代谢自由能”的定义；并且热力学效率η受所有数据第二定律的约束。因此，我们的系统分析将许多先前具有不同程度支持的观察结果调和为两个约束跨生命领域单细胞生长的经验热力学规则。

我们的工作不可避免地受到几个限制的影响。首先，我们解析的大部分数据缺乏时间尺度和个体通量的信息。为了规避这个限制，我们使用产量而不是通量来量化生长和能量学，并定义每电子供体的耗散σ。此外，在补充图8中，我们显示了来自连续培养的数据，其中速率已知，中值耗散速率为每克干生长生物质1瓦特。其次，在大多数实验中，仅测量了 accounting for the耗散所必需的交换的一个子集。因此，我们依赖元素守恒来估计缺失的产量，伴随着准确性的损失。第三，我们对代谢类型和生物质组成的定义过于简单化，因为它们忽略了微量营养素和必需元素（如磷和硫）。尽管对生命不可或缺，我们假设这些贡献很小，并且对热力学平衡的影响很小。

鉴于通量在细胞生理学和能量学中的重要性，未来的细胞能量学实验研究进行所有通量的全面测量至关重要。我们期望新颖的实验技术与粗粒化以及微观预测模型相结合，将为我们 empirical findings 的起源提供机制 insight。

总之，我们的工作构成了连接非平衡热力学与细胞生理学的一步。我们在这个方向上的进展对广泛不同的领域具有影响。例如，该数据集可用作生物地球化学循环模型的基础，但它也可以指导连接哺乳动物代谢、生长和热力学在健康和疾病系统中的研究。此外，由于数据集是开放的，它可以被扩充以包括其他代谢类型，如光合作用，从而扩展能量学的生态研究。最后，虽然我们没有参考细胞内过程，但我们的方法可以 bridge 与代谢或信号网络热力学的联系。总体而言，我们 established 的两个经验规则构成了代谢与热力学之间 long sought-after 的联系。

本研究基于从已发表文献收集的数据。除四种情况外，我们 even when we started from existing databases 从原始参考文献解析了所有数据。在补充信息G1中，我们描述了策展过程，并在补充信息G3中为每个参考文献提供了详细信息。我们在补充数据1中报告了策展产量，在补充数据3中报告了实验的辅助信息（所有参考文献见补充数据7）。在框2中，我们说明了如何从参考文献中提供的实验测量开始，我们计算自由能的耗散。在框3中，我们提供了一个说明性示例。简而言之，我们选择了与理论框架假设兼容的实验（框1和补充信息C）。这包括受控实验室条件、单一物种在连续或分批培养中的稳态生长、使用最小培养基以及生物量和最小交换通量或产量集的测量。使用元素守恒，我们计算每电子供体所有交换通量的产量值（框2）。所有值报告在补充数据2中。如果未报告生物质的元素组成，我们使用了来自不同来源的最接近相关物种的可用数据（补充信息I1和使用的值见补充数据4）。每消耗电子供体的自由能耗散使用营养物质和产物的形成自由能（补充信息H）和生物质（补充信息I）计算。我们考虑了实验的温度和pH（补充信息H），但假设水溶液中化学物质的“生物标准”浓度（1mM）。在补充数据5中，我们报告了用于交换化学物质的热力学性质。热力学计算的结果报告在补充数据6中。

所有解析的数据使用Python v3.8.5进行处理和分析，使用NumPy、SciPy和pandas库进行线性代数计算、线性拟合和统计分析，如主文、图例和补充信息中所解释。

在最初选择与我们的建模假设兼容的参考文献后，我们仅排除了数据的一小部分。在少数情况下，元素守恒要求消耗一种化学物质，尽管参考文献指示其为产物，反之亦然。这发生在ref. 58的厌氧发酵数据上，我们将其从本研究中排除。在另一种情况下，五个数据点导致负耗散，即违反第二定律。我们排除了这个来源，因为我们假设它没有提供实验中使用的产物和底物的足够信息。