Cas9通过稳定核糖体-mTORC2互作激活信号通路调控细胞生长的机制研究

本研究针对CRISPR-Cas9基因编辑技术中稳定表达的细菌源Cas9蛋白对哺乳动物细胞行为的潜在影响这一重要安全问题，通过系统性筛选32种细胞系发现Cas9表达可特异性调控细胞生长。研究人员通过建立SpCas9相互作用组学，发现核糖体蛋白是其主要相互作用伙伴，并揭示Cas9通过支架作用增强RPL26/RPL23a与mTORC2核心组分Sin1的结合，进而激活mTORC2/Akt信号通路促进细胞生长的分子机制。该研究为CRISPR技术安全应用提供了重要理论依据，对设计更安全的Cas9变体具有重大意义。

　　

随着CRISPR-Cas9基因编辑技术的革命性发展，细菌来源的Cas9核酸酶已成为生物医学研究和临床治疗的核心工具。然而，这种外源蛋白在哺乳动物细胞中的长期表达是否会影响细胞自身功能，始终是领域内关注的安全隐患。尽管先前研究揭示了Cas9可能引发p53介导的DNA损伤反应、导致染色体异常删除和基因组重排等问题，但其对细胞基本行为如生长调控的影响仍缺乏系统研究。特别是在CRISPR筛选和基因治疗中，Cas9的稳定表达是否会给实验结果或治疗效果带来偏差，成为亟待解答的重要科学问题。

在这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究中，研究人员通过多组学技术手段揭示了Cas9蛋白调控细胞生长的新机制。研究团队首先通过慢病毒感染构建了32种细胞系（涵盖9种癌症类型和4种非癌细胞系）的Cas9稳定表达模型，并设置空载体对照。利用二维集落形成实验进行系统筛选后，发现Cas9表达在特定细胞系（如DU145、MDA-MB-231等）中显著促进细胞生长。通过免疫共沉淀-质谱联用技术（Co-IP/MS）建立SpCas9相互作用组，鉴定出核糖体蛋白（RPL/RPS）为Cas9的关键结合伙伴。转录组测序（RNA-seq）分析表明Cas9表达激活PI3K-Akt信号通路。机制研究表明，核糖体蛋白RPL26和RPL23a直接结合mTORC2复合物的关键组分Sin1，而Cas9作为分子支架稳定这种相互作用，即使在血清饥饿条件下也能维持mTORC2激酶活性。体外实验证实重组Cas9蛋白可增强RPL23a与Sin1的结合能力，从而促进mTORC2对Akt Ser⁴⁷³位点的磷酸化。该研究为理解细菌蛋白与哺乳动物细胞信号网络的互作提供了新视角，对改进CRISPR技术安全性具有重要指导意义。

稳定SpCas9表达对32种细胞系生长的谱系分析

研究人员通过慢病毒感染在32种细胞系中建立稳定表达SpCas9的模型，并设置空载体对照（NC）。通过免疫印迹验证Cas9-Flag表达后，利用二维集落形成实验评估细胞生长变化。结果显示在7种细胞系中Cas9和NC对生长影响较小，而11种细胞系中NC病毒感染本身显著抑制生长。特别值得注意的是，在RCC4、MDA-MB-231、MDA-MB-453、DU145和PC3细胞中，Cas9表达显著促进细胞生长，而在MCF-7和MIA PaCa-2细胞中则抑制生长。这些变化与NRF2蛋白水平无必然关联，表明存在其他机制主导Cas9的生长调控作用。

SpCas9相互作用组分析揭示核糖体蛋白为主要结合伙伴

在生长受Cas9促进的DU145和MDA-MB-231细胞中，研究人员通过Flag免疫沉淀结合质谱分析（IP-MS）构建了Cas9的蛋白质相互作用网络。以log₂(FC)≥1且P<0.05为阈值，在DU145和MDA-MB-231细胞中分别鉴定出500和200个Cas9特异性结合蛋白。基因本体（GO）分析显示这些蛋白显著富集于核糖体相关通路，包括60S（RPL）和40S（RPS）核糖体亚基成分。值得注意的是，RPL26是两个细胞系共同的主要相互作用蛋白，提示核糖体-Cas9相互作用在Cas9介导的生长调控中可能发挥核心作用。

SpCas9通过核糖体关联调控mTORC2活化而非mRNA翻译效率

通过荧光标记的蛋白合成检测实验，发现NC病毒感染本身显著降低DU145细胞的mRNA翻译效率，而Cas9表达并未进一步改变翻译水平。RNA-seq分析显示Cas9表达导致3,924个基因上调和4,504个基因下调，KEGG通路分析显著富集于PI3K-Akt信号通路。基因集富集分析（GSEA）进一步证实"跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶信号的正调控"通路激活。免疫印迹分析发现在DU145、PC3和RCC4细胞中，Cas9表达显著增强Akt Ser⁴⁷³磷酸化（p-Akt S⁴⁷³）水平，且即使在血清饥饿条件下也能维持mTORC2活性。药物敏感性实验表明Cas9表达细胞对mTOR抑制剂Torin 2、Akt抑制剂MK2206等更敏感，证实Cas9促进的生长依赖mTORC2/Akt信号通路。

SpCas9通过结合Sin1桥接核糖体与mTORC2促进其活化

机制研究表明，RPL26过表达可增强mTORC2活性，且该效应依赖Sin1存在。RPL26特异性结合Sin1的N端和RBD结构域，而不与其他mTORC2组分结合。重要的是，RPL26能够解除Sin1-PH结构域对mTOR激酶域的抑制效应，从而激活mTORC2。实验证实Cas9直接与Sin1（及GβL）结合，且通过其PH结构域增强RPL26与Sin1的相互作用。类似地，另一核糖体蛋白RPL23a也通过类似机制调控mTORC2活性。体外激酶实验显示，在血清饥饿条件下获得的mTORC2复合物活性降低，而加入重组Cas9蛋白可恢复其激酶活性，证实Cas9直接促进核糖体-mTORC2互作。敲低内源RPL26或RPL23a可减弱Cas9介导的Akt激活，进一步验证了该机制。

本研究系统揭示了稳定表达的Cas9蛋白通过"分子支架"作用增强核糖体蛋白与mTORC2核心组分Sin1的相互作用，从而激活mTORC2/Akt信号通路促进细胞生长的分子机制。这一发现不仅解释了Cas9表达在不同细胞系中产生异质性生长效应的原因，更重要的是揭示了细菌源蛋白与哺乳动物细胞信号网络互作的新模式。

从技术应用角度，该研究结果对CRISPR筛选实验的设计和解释具有重要指导意义。由于Cas9表达本身可能改变细胞生长特性，在基于CRISPR的功能基因组筛选中需谨慎设置对照并合理解读结果。特别值得注意的是，Cas9在血清饥饿条件下仍能维持mTORC2活性的特性，提示其在营养应激条件下可能产生更显著的生物学效应。

从临床安全角度，该研究强调了基因治疗中控制Cas9表达时长和剂量的重要性。长期表达Cas9可能通过持续激活生长信号通路带来潜在风险，这为开发可诱导型、自失活型Cas9系统提供了理论依据。同时，研究提示不同细胞类型对Cas9表达的响应存在差异，在临床应用中需要针对特定细胞类型进行安全性评估。

该研究还拓宽了对核糖体非翻译功能的认识。核糖体作为mTORC2的调节器，其与细菌蛋白的意外互作可能反映了进化过程中保守的细胞应激响应机制。类似现象可能在其它细菌源蛋白的应用中同样存在，值得进一步探索。

总之，这项研究不仅为CRISPR技术的安全应用提供了重要科学依据，也为理解跨物种蛋白互作、细胞信号网络调控提供了新视角。未来针对Cas9-核糖体-mTORC2轴的研究可能催生更安全的基因编辑工具，推动精准医疗发展。